《Sensors and Actuators B: Chemical》：Color-Space Enhanced Intelligent Immunosensor for Multiplex Veterinary Drug Detection: A User-Friendly Fluorescence Analysis Platform
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兽药残留多联检测方法研究：开发双测试线、双颜色荧光层析法，整合RGB/HSV/LAB/LCH颜色空间与线性/对数/对数对数/四参数模型，建立抗干扰定量解码算法，实现SM2/AMD/ENR/TYL四残留同步检测，检测限0.049-100 ng/mL，变异系数≤7.61%，配套3D打印便携式荧光设备。
肖小月|赖一辉|张甘|黄旭汉|刘茜霞|赖伟华
湖北省食用野生植物保护与利用重点实验室，湖北师范大学，湖北省黄石市，435002，中国
摘要
食品中多种兽药残留物的存在日益严重，给食品安全和监管带来了重大挑战。传统的单一分析方法无法满足高通量筛查的需求，因此亟需快速、灵敏且多目标的检测平台。本研究开发了一种双测试线、双色荧光侧向流动免疫测定法（DDF-LFIA），用于同时检测四种兽药：磺胺甲噁唑（SM2）、金刚烷胺（AMD）、恩诺氟沙星（ENR）和泰乐菌素（TYL）。通过整合四种颜色空间（RGB、HSV、LAB和LCH）和四种拟合模型（线性、对数、对数-对数和4PL），开发了一种定制的解码算法，以解决多色编码带来的信号干扰问题。该方法不依赖于单一预定义的颜色通道，而是能够在多色干扰条件下自适应选择最佳解码方案，从而建立颜色信号与目标浓度之间的定量关系。在评估的各种组合中，RGB颜色空间与4PL模型的组合表现出最高的准确性和稳健性。此外，还制造了一种适用于智能手机的3D打印荧光检测装置，实现了便携式检测。DDF-LFIA对SM2、AMD、ENR和TYL的检测限分别为0.39、1.56、0.19和6.25 ng/mL。SM2、AMD、ENR和TYL的定量检测范围为0.049–100 ng/mL，IC50值分别为0.69、12.40、0.78和22.20 ng/mL，回收率在80.77%–115.79%之间，变异系数≤7.61%。这项工作为LFIA中的多色干扰问题提供了实用且智能的解决方案，为现场食品安全监测提供了一种有前景的工具。
引言
兽药被广泛用于预防和治疗动物疾病[1]、[2]。然而，这些药物的滥用或过度使用会导致食品中残留物过多。这些残留物对消费者健康构成严重风险，包括毒性作用、过敏反应以及抗生素耐药性的产生[3]、[4]、[5]、[6]。此外，为了提高治疗效果，经常同时使用多种兽药，从而导致食品和环境中出现多种药物残留[7]。例如，磺胺甲噁唑（SM2）、金刚烷胺（AMD）、恩诺氟沙星（ENR）和泰乐菌素（TYL）是常见的兽药，它们可能同时存在于禽类产品中。能够在单一检测中检测多种目标的方法因其时间效率、全面的样本分析和成本降低而受到重视[8]、[9]。因此，开发快速可靠的兽药残留物多目标检测方法已成为当务之急。
已经建立了多种多目标检测技术，包括高效液相色谱（HPLC）[10]、[11]、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）[12]、气相色谱-串联质谱（GC–MS/MS）[14]、[15]、表面增强拉曼散射（SERS）[16]、[17]、酶联免疫吸附测定（ELISA）[18]、[19]和侧向流动免疫测定（LFIA）[20]、[21]、[22]。其中，LFIA因其快速响应、简单性和低成本而特别吸引人，非常适合需要多目标检测的现场应用[23]、[24]。在LFIA中，采用多色信号标记是一种广泛采用的技术，以实现多目标分析[25]、[26]、[27]、[28]、[29]。然而，随着目标分析物数量的增加，确保准确的颜色区分成为一个主要挑战[20]。重叠的颜色信号或色调的微妙变化可能导致误判和定量精度降低，尤其是在光照条件变化或视觉检查时。这些限制阻碍了当前基于多色的LFIA的可靠性和可扩展性，凸显了提高信号分辨率和增强基于颜色的定量准确性的迫切需求。
在多色检测中，准确的颜色区分至关重要。多维颜色空间中的数字颜色表示提供了一种潜在的解决方案，每种颜色空间定义了不同的色彩属性。常用的颜色空间包括RGB、LAB、HSV和LCH，每种颜色空间都提供了独特的颜色表示视角[30]。选择合适的颜色空间对基于数字图像分析的检测算法的准确性和一致性有很大影响[31]。尽管最近的研究报道了各种颜色探针，但大多数研究仍集中在单一分析物的单独测试区域或比率荧光定量上[32]、[33]。真正的多色编码信号复用技术，即通过不同的颜色通道同时实现多目标检测，尚未得到充分探索。
本研究提出了一种双测试线、双色荧光LFIA（DDF-LFIA），用于同时检测SM2、AMD、ENR和TYL残留物。为了提高多目标结果的准确性和可解释性，我们采用了先进的信号处理策略和稳健的数学模型。如图1A所示，每个T线上固定了两种完整的抗原，红色和绿色量子点微球与特定抗体结合，作为荧光探针，能够在单个样本中同时定量四种兽药。在不同条件下捕获试纸条的图像，并提取其颜色信息（图1B）。应用了一种定制算法，整合了四种颜色空间（RGB、HSV、LAB和LCH）和四种拟合模型（线性、对数、对数-对数和4PL），以建立输出信号与分析物浓度之间的定量关系（图1C）。所提出的DDF-LFIA方法旨在解决多色干扰问题，实现多种兽药残留物的准确检测，为基于颜色编码信号分析的多重免疫测定法的发展提供了一种新策略。
试剂和仪器
磷酸盐缓冲液（PB）、硼酸盐缓冲液（BB）、酪蛋白和磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.01 M，pH 7.4）从Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）购买。针对SM2、AMD、ENR和TYL的单克隆抗体（mAbs）由江西伟邦生物科技有限公司（中国南昌）提供。完整的抗原（包括SM2-BSA、AMD-BSA、ENR-BSA和TYL-BSA）在我们的实验室制备。SM2和其他磺胺类（SA）抗生素以及ENR和其他氟喹诺酮类（FQ）抗生素也进行了相关准备。量子点和探针的表征
在本研究中，使用了RQMs和GQMs来实现基于荧光的LFIA中的颜色变化。透射电子显微镜（TEM）图像（图1A和1B显示，RQMs和GQMs均具有明确的球形形态，平均直径分别为217.0 nm和299.6 nm（通过动态光散射（DLS）确定，图1C和1D）。这两种量子点在300–400 nm范围内都有强烈的激发，但发射光谱不同。结论
本研究成功开发了一种双测试线、双色荧光侧向流动免疫测定法（DDF-LFIA），用于同时灵敏地检测四种常见的兽药残留物：SM2、AMD、ENR和TYL。通过整合四种代表性的颜色空间（RGB、HSV、LAB和LCH）和四种拟合模型（线性、对数、对数-对数和4PL），建立了一个系统框架，用于评估基于颜色编码的多目标检测中的信号区分和定量分析。
一个定制的
伦理批准
本文不包含任何作者进行的涉及人类参与者或动物的研究。
CRediT作者贡献声明
赖伟华：撰写 – 审稿与编辑，项目管理，资金获取。刘茜霞：监督，方法学。黄旭汉：资源，调查。张甘：资源，调查。赖一辉：撰写 – 原稿，软件，数据管理。肖小月：撰写 – 原稿，方法学，形式分析，概念化。写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT来改进语言表达。使用该工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物的内容负全责。利益冲突声明
作者肖小月、赖一辉、张甘、黄旭汉、刘茜霞、赖伟华声明没有利益冲突。致谢
本研究得到了湖北省食品科学与资源重点实验室（SKLF-ZZB-202315）研究项目的资助；以及江西省农业研究系统（JXARS-03）的专项经费支持。作者感谢王继坤博士在算法开发方面提供的帮助。利益冲突
作者肖小月、赖一辉、张甘、黄旭汉、刘茜霞、赖伟华声明没有利益冲突。本文不包含任何涉及人类参与者的研究。
肖小月于2025年在中国南昌大学获得食品科学与工程博士学位。2023年至2024年期间，她作为访问学者在加州大学戴维斯分校工作。目前她是湖北师范大学的讲师，主要从事基于纳米材料的多种危害检测和智能检测平台的开发研究。
