RBX1和RBX2促进草鱼（Ctenopharyngodon idella）中GCRV的复制

《Fish & Shellfish Immunology》：RBX1 and RBX2 promote GCRV replication in grass carp ( Ctenopharyngodon idella)

本研究发现Rbx1和Rbx2通过调控IRF3和IRF7的泛素化降解促进病毒复制，揭示鱼类RBX蛋白在干扰素信号中的进化保守负调控作用。

　　

Jianhua Feng|Yafang Wang|Wenji Huang|Dawei Xie|Yinghao Huang|Xinran Tao|Tiantian Zhang|Haixia Wu|Jun Zou|Junya Wang

教育部水生遗传资源勘探与利用重点实验室，上海海洋大学，上海，201306，中国

摘要

Cullin–RING连接酶（CRLs）是泛素-蛋白酶体系统中多样性最高的E3连接酶家族，但它们在硬骨鱼类中的抗病毒作用仍不甚明了。在本研究中，我们确定了CRLs的催化核心——RING-box蛋白RBX1和RBX2，作为鲤科鱼类抗病毒信号传导的关键调节因子。系统发育和结构分析表明，Rbx1和Rbx2具有高度保守性，并在原始生殖细胞和免疫相关细胞中广泛表达。当鲤科鱼类感染草鱼呼肠孤病毒（GCRV）或鲤春病毒（SVCV）时，Rbx1和Rbx2在体内和体外均迅速被诱导。RBX1和RBX2通过与干扰素调节因子（IRF）3和IRF7直接相互作用并促进其泛素介导的调控，从而协同促进病毒复制。我们的发现揭示了RBX1和RBX2作为鱼类先天免疫的进化保守负调节因子，并为理解脊椎动物中泛素介导的干扰素稳态调控机制提供了机制上的见解。

引言

泛素-蛋白酶体系统（UPS）是一种高度保守的机制，负责选择性蛋白质降解，在细胞稳态、信号转导和免疫调节中发挥基础性作用[1]、[2]。在该系统中，Cullin-RING E3连接酶（CRLs）是最大且功能最多样化的E3家族，通过模块化适配器复合物介导底物特异性泛素化[3]。CRLs的催化活性由RING-box蛋白RBX1和RBX2驱动，它们招募E2结合酶并将泛素转移到目标底物上[4]。尽管RBX1和RBX2在结构上具有相似性，但越来越多的证据表明，它们在发育、氧化应激反应和免疫调节中具有不同的生物学功能[5]、[6]。

除了在蛋白质稳态中的传统作用外，RBXs还成为免疫信号传导的关键调节因子[6]、[7]。在哺乳动物中，RBX1和RBX2参与NF-κB和干扰素（IFN）通路中信号分子的降解，从而调节先天性和适应性免疫反应[7]、[8]。尽管RBX1和RBX2存在部分冗余，但它们具有不同的生物学功能[6]。RBX1在果蝇（Drosophila melanogaster）[9]、小鼠（Mus musculus）[11]和斑马鱼（Danio rerio）[12]中持续表达且对发育至关重要。RBX2也是CRLs泛素连接酶复合物的催化亚基，具有泛素和NEDD8连接酶活性，通过底物泛素化调节细胞周期、细胞凋亡和氧化应激[13]。尽管有这些发现，RBXs在抗病毒信号传导中的作用仍大多未被探索，尤其是在低等脊椎动物中。

作为抗病毒免疫的核心转录因子，IRF3和IRF7经常受到靶向的翻译后修饰，以精细调节宿主免疫反应[14]。例如，TRIMs家族的多个成员作为E3泛素连接酶促进IRF3或IRF7的泛素化和降解，从而负调节I型干扰素的产生并防止过度的抗病毒免疫激活[15]、[16]。I型干扰素的反应主要依赖于IRF3和IRF7，它们在病毒感染期间通过磷酸化和二聚化被激活[17]、[18]。这些因子驱动干扰素基因及其下游干扰素刺激基因（ISGs）的表达，构成了抗病毒防御的核心[19]、[20]。因此，IRF3和IRF7的翻译后修饰，特别是泛素化，已成为控制其稳定性和活性的关键机制[21]、[22]。然而，尽管已有报道指出RBXs参与干扰素信号传导，但它们在调节由IRF3、IRF7或其他RLR相关因子介导的抗病毒信号传导中的潜在作用尚未得到系统研究。

在这里，我们研究了RBX1和RBX2在鲤科鱼类抗病毒免疫中的功能。通过综合表达分析、病毒挑战和机制实验，我们证明RBX1和RBX2通过介导IRF3和IRF7的泛素依赖性降解来协同促进病毒复制。我们的发现表明RBX1和RBX2是鱼类I型干扰素信号的进化保守负调节因子，并揭示了脊椎动物中泛素介导的免疫调节的基本机制。

章节片段

鱼类

草鱼（Ctenopharyngodon idella）从上海滨海水产基地获取，并在28 ± 1 °C的室内循环淡水中驯养至少两周后进行实验。斑马鱼（AB品系）和稀有鲦鱼（Gobiocypris rarus）由中国斑马鱼资源中心（CZRC，http://www.zfish.cn/）提供。鱼类在充氧的淡水中维持，温度控制在28 ± 1 °C（斑马鱼）和26 ± 1 °C（稀有鲦鱼）。用于腹腔注射实验的鱼类均来自这些来源。

序列分析

获得了草鱼RBX1和RBX2的全长编码序列，分别编码108个和113个氨基酸的蛋白质，这两种蛋白质均不含预测的信号肽。系统发育分析显示，RBX1和RBX2形成了两个不同的进化支系，尽管每个支系内的个体谱系关系尚未明确。（图1A）。同线性分析表明，RBX1位于ST13和XPNPEP3附近，局部基因顺序发生了重排。

讨论

RBXs是高度保守的RING-box蛋白，作为CRLs的催化亚基，在多种细胞过程中发挥关键作用[33]、[34]、[35]。然而，它们在低等脊椎动物抗病毒免疫中的作用仍不清楚。在本研究中，我们确定了草鱼中的RBX1和RBX2，并证明了它们的基因组成、结构特征和表达模式在脊椎动物中高度保守。此外，在GCRV感染期间，RBX1和RBX2发挥了重要作用

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

CRediT作者声明

Jianhua Feng、Yafang Wang：负责研究、方法学设计、数据整理和原始稿件的撰写。Wenji Huang、Dawei Xie、Yinghao Huang、Xinran Tao、Tiantian Zhang、Haixia Wu：负责研究和方法学设计。Jun Zou、Junya Wang：负责概念构思、资金获取、项目管理、监督、审稿和编辑。

数据可用性

数据可应要求提供。

致谢

我们衷心感谢中国科学院水生生物学研究所的Zhen Xu博士提供了GCRV-YX246菌株。同时感谢湖南农业大学的Yaoguo Li博士提供了GCRV-873菌株。本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：32373166、32030112）的支持。