PRRSV核衣壳蛋白和非结构蛋白通过ATF-2和AP-1通路双重调控CD40的表达

《Veterinary Microbiology》：PRRSV Nucleocapsid and Nonstructural Proteins Dual-Regulate CD40 Expression via ATF-2 and AP-1 Pathways

PRRSV感染通过调控巨噬细胞CD40表达影响免疫反应，发现病毒N蛋白通过ATF-2增强CD40，而非结构蛋白Nsp1α/Nsp11/Nsp12通过AP-1抑制CD40，CD40过表达可抑制病毒复制。

　　

傅超伦|高红艳|李英超|刘长|赵玉忠|李友波|刘忠|卢曼|沈阳|邢亚静|王宇|吴晓通|杨萍萍|肖一红

山东农业大学兽医学院，中国泰安，271018

摘要

巨噬细胞表面分子在调节炎症反应中起着关键作用。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种具有显著嗜性亲和力的免疫抑制性病原体，它通过调节宿主表面受体的表达来促进感染。在本研究中，我们筛选了PRRSV感染期间免疫调节分子的表达情况，并确定CD40是上调最显著的转录本。研究表明，PRRSV核衣壳蛋白（N）能够增强CD40启动子的活性，而非结构蛋白Nsp1α、Nsp11和Nsp12则会抑制其活性。从机制上讲，N蛋白通过转录因子ATF-2上调CD40的表达，而Nsp1α、Nsp11和Nsp12则通过AP-1下调CD40的表达。CD40的过表达限制了PRRSV的复制，这表明它可能成为抗病毒策略的目标。

引言

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是导致该疾病的病原体，会引起母猪严重的繁殖障碍以及所有年龄段猪只的呼吸系统疾病，尤其是仔猪的死亡率较高（Lunney等人，2016年）。自该病毒出现以来，其遗传特性和毒力表现出显著多样性。高致病性PRRSV（HP-PRRSV）菌株的进化在中国和东南亚引发了大规模的疫情，例如2006年在中国南方影响了超过两百万头猪的疫情（Li等人，2007年；Tian等人，2007年；Lv等人，2008年；Zhou等人，2008年；Ruedas-Torres等人，2021年）。2014年，中国报告了类似NADC30的变异株，随后在NADC30类似株和HP-PRRSV分离株之间检测到了越来越多的重组株，这使得病毒进化变得更加复杂，并削弱了疫苗的效果（Zhou等人，2008年；Ruedas-Torres等人，2021年；An等人，2020年）。

免疫共刺激分子和共抑制分子在调节炎症反应中起着核心作用，尤其是在T细胞介导的免疫过程中。研究表明，PRRSV感染会改变表面分子的表达，从而促进病毒复制（An等人，2020年）。例如，PRRSV-1感染会上调肺部组织中的共刺激分子（如CD28、CD226、ICOS、CD40）和共抑制分子（如CTLA4、PD-1、TIM3）的表达，其中抑制信号通常占主导地位，导致免疫失衡和肺部病理变化（Ruedas-Torres等人，2022年）。PRRSV还会诱导树突状细胞表达PD-L1，这可能是其抑制T细胞反应的机制之一（Tang等人，2021年）。CD40是一种关键的免疫共刺激分子，它与CD40L结合，激活下游信号通路——包括NF-κB、MAPK和PI3K通路——从而连接先天免疫和适应性免疫（Tang等人，2021年）。巨噬细胞中的CD40信号传导已被证明可以通过促进IL-12和IFN-γ的产生来限制多种RNA病毒（如VVSV、IAV和EBOV）的复制，驱动促炎性巨噬细胞的极化（Van den Eertwegh等人，1993年；Rogers等人，2021年）。

由于猪肺泡巨噬细胞（PAMs）是PRRSV的主要靶细胞（Li等人，2007年），我们研究了感染期间免疫调节表面分子的表达情况。在这些分子中，CD40 mRNA的上调最为显著。本文探讨了CD40表达与PAMs中PRRSV感染之间的功能相互作用。

章节片段

细胞与病毒

PRRSV易感的猴肾细胞系MARC-145和人胚胎肾293（HEK293T）细胞由中国典型培养物中心（武汉）提供。细胞在添加了10%胎牛血清（FBS；Biological Industries，Beit HaEmek，以色列）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Gibco，Langley，OK，美国）中培养，培养条件为37°C，培养环境为5%二氧化碳的湿润环境。猪肺泡巨噬细胞（PAMs）从五只健康的5周龄猪只中分离获得。

HP-PRRSV感染改变了PAM中免疫检查点分子的表达

从六只5周龄的仔猪中分离出的PAMs被高致病性PRRSV菌株TA-12感染，以评估免疫检查点分子表达的变化。定量分析显示，感染上调了CD40、CD40L、GAL9和TIM3的mRNA水平，同时下调了ICOSL和LAG3的水平（图1）。GITR的表达在个体间存在差异，而ICOS的水平基本保持不变。CD40在所有动物中的上调最为一致且显著。

讨论

PRRSV通过调节免疫细胞表面分子来巧妙地调控宿主的免疫反应，这些分子包括共刺激分子（如CD40、ICOS、OX40）和检查点分子（如PD-1、CTLA-4），共同精细调节免疫激活（Esen等人，2021年）。这种免疫调节能力可能导致PRRSV相关的继发感染，如猪圆环病毒病和细小病毒病，因为宿主的防御机制受到削弱（Ma等人，2021年）。

伦理批准和参与同意

不适用

资金来源

本研究得到了中国国家重点研发计划（项目编号2022YFD1800303，负责人Y.X.）和中国国家自然科学基金（项目编号32072818，负责人Y.X.）的支持。

未引用的参考文献

Van den Eertwegh等人，（1993年）；Wang等人，（2015年）

出版同意声明

不适用。

CRediT作者贡献声明

FC、GH、YL、LC、ZY、LY、LZ、LM、SY、XY、WY和YX进行了研究并解释了结果。FC、GH、LH、YL、YP和YX参与了数据收集。FC、GH、LH、YP和YX参与了数据分析并协助撰写了手稿。所有作者均阅读并批准了最终版本的手稿。

CRediT作者贡献声明

刘忠：研究、数据管理。卢曼：研究。赵玉忠：方法学、研究。李友波：研究、数据管理。李英超：研究、数据管理。刘长：研究。杨萍萍：写作——审阅与编辑、资源管理、方法学。高红艳：写作——初稿撰写、方法学、研究、数据管理。肖一红：写作——审阅与编辑、初稿撰写、验证、监督、数据管理、概念构思。王宇：研究。

利益冲突声明

作者声明本研究在没有任何可能被视为利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。

致谢

我们感谢西北农林大学的赵秦提供了PAM^CD163CD169细胞。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。