综述：新型HIV蛋白酶抑制剂开发进展

《Annals of Medicine》：Advancements in development of novel class of HIV protease inhibitors

本综述系统阐述了HIV蛋白酶抑制剂(PIs)在高效抗逆转录病毒治疗(HAART)中的核心地位及其多步骤抗病毒机制。文章重点分析了当前PIs面临的主要耐药突变问题（包括活性位点与非活性位点突变），并前瞻性地提出三类新型PIs研发方向：靶向传统活性/非活性/切割位点的强效抑制剂、针对多药耐药(MDR)病毒株的抑制剂以及作用于HIV复制多阶段的多功能抑制剂，为克服耐药挑战提供了新思路。

　　

Abstract

背景

蛋白酶(PR)抑制剂(PIs)被广泛认为是治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)的最重要药物，并且在高效抗逆转录病毒治疗(HAART)的成功中发挥了关键作用。PR酶对于病毒生命周期至关重要，因为它将各种多蛋白切割成形成成熟、具有感染性病毒粒子所需的单个组件。

方法

我们系统综合了当前证据，揭示了PIs的多方面作用，其可以作为进入抑制剂、逆转录抑制剂和逆转录后过程抑制剂。

结果

所有当前可用的PIs都面临着新兴耐药病毒株的挑战，这需要探索能够克服这种耐药性的新型PIs。

结论

本综述探讨了PIs的当前格局、导致耐药的主要PR突变，并确定了三类值得在抗HIV药物开发中考虑的新型PIs：(i) 对PR的传统活性、非活性和切割位点表现出强大抑制活性的新型PIs；(ii) 旨在靶向耐药PR变体，特别是那些与多药耐药(MDR) HIV分离株相关的新型PIs；(iii) 作用于HIV复制多个阶段的新型PIs，从而增强PIs的抗HIV功效。

Introduction

HIV-1的根除在不久的将来似乎不可行，部分原因是病毒库在血液和受感染组织中的持续存在。目前，高效抗逆转录病毒治疗(HAART)是对抗人类免疫缺陷病毒(HIV)的主要干预措施。HAART的实施显著降低了HIV相关的发病率和死亡率，这归因于其疗效。这种治疗方法可以通过使用多种（通常是三种）抗病毒药物的组合，将病毒载量有效降低到检测不到的水平（血浆HIV-1 RNA <50 copies/mL），每种药物靶向病毒生命周期的不同阶段。HIV生命周期可系统分为10个不同阶段，其中大多数已被确定为化学治疗干预的潜在靶点。虽然进入抑制剂和整合酶(IN)链转移抑制剂已被纳入药物组合，但蛋白酶抑制剂(PIs)和逆转转录酶(RT)抑制剂仍然是HAART的基本组成部分。实际上，大多数已获批准用于HIV感染临床治疗的药物可分为四个主要类别：(i) 核苷和核苷酸逆转录酶抑制剂(NRTIs)，包括齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨、司他夫定、拉米夫定、阿巴卡韦和替诺福韦；(ii) 非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs)，如奈韦拉平、地拉韦定和依非韦伦；(iii) PIs，包括沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安普那韦和洛匹那韦；(iv) 整合酶链转移抑制剂(INSTIs)，如拉替拉韦、埃替拉韦、比替拉韦、卡博特韦和多替拉韦。

针对PR活性位点的抑制剂开发已取得显著成功。早在20世纪90年代，PIs就被确定为抗HIV药物开发的重要焦点。自1995年美国食品药品监督管理局(FDA)批准首个上市的PI沙奎那韦以来，共有10种PIs获得FDA批准并已有效用于HIV感染的临床实践。PIs已成为治疗艾滋病的重要组成部分。本综述旨在审视PIs的当前格局，重点分析与耐药相关的主要蛋白酶(PR)突变，以及旨在规避此类耐药的新型PIs类别开发的最新进展。此外，我们将探讨创新PI类别开发的前瞻性途径，因为对PI相关耐药性和PIs抗HIV作用的分子机制的理解，需要制定新的PI开发策略。

Mechanisms of PIs in blocking viral replication at multiple steps of the HIV life cycle

HIV PR对于病毒成熟至关重要，因为它促进病毒多蛋白的切割。HIV基因组编码的三种多蛋白被PR切割：包膜前体蛋白(Env, gp160)、Gag前体蛋白(Pr55^Gag)和Gag-Pol前体蛋白(Pr160^Gag-Pol)。包膜前体蛋白被细胞PR切割成两个亚基，gp120和gp41，它们在切割后仍保持关联形成gp120/gp41复合物。这些gp120/gp41复合物形成的三聚体构成HIV表面刺突，促进穿透人体细胞。此外，Gag和Gag-Pol多蛋白在新生病毒中被HIV-1 PR切割，产生形成能够感染其他细胞的新病毒粒子所需的多种成熟蛋白。Pr55^Gag多蛋白被切割产生基质蛋白(MA, p17)、衣壳蛋白(CA, p24)、核衣壳蛋白(NC, p7)和p6蛋白，以及p1和p2间隔肽。Gag-Pol多蛋白中Pol结构域的切割产生三种病毒酶：PR、RT和IN，以及RT二聚体的51 kDa和66 kDa亚基。成熟病毒核心的正确组织需要这些多蛋白的蛋白水解切割以严格调控和特定的顺序事件发生。由于其在病毒生命周期中的关键作用，HIV-1 PR已成为一个极具吸引力的治疗干预靶点。

PIs主要通过抑制HIV-1 PR的酶活性发挥作用。这些抑制剂的设计主要基于对PR、其底物以及肽键切割生化机制的结构见解。由于PR在促进HIV-1生命周期的各个早期阶段中起着关键作用，PIs对HIV-1 PR的拮抗可以干扰几个初始过程，包括病毒进入、融合、逆转录和核输入。研究表明，在PIs存在下产生的新病毒在进入阶段存在缺陷。此外，PIs对逆转录和逆转录后过程的多效性作用已被研究。在所有评估的PIs中，发现在一个主要规避了进入抑制的系统中，PIs能抑制逆转录。此外，PIs通过阻碍成熟IN的形成来阻止整合。Rabi等人研究了PIs对进入后步骤的抑制作用。他们的发现表明，PIs在病毒生命周期的多个阶段阻碍HIV复制，包括进入和进入后过程。

鉴于PIs在HIV生命周期的各个阶段的重要作用，这些药物对于HIV感染的管理至关重要。值得注意的是，PIs是唯一一类单药治疗在抑制病毒复制方面被证明与联合治疗同样有效的抗HIV药物类别，临床试验结果证明了这一点。观察到的结果可归因于PIs影响HIV复制多个阶段的能力，从而实现了显著高的抗病毒活性。据推测，这种升高的抗病毒功效是通过类似于RT抑制剂、IN抑制剂和进入抑制剂组合使用的机制实现的。除了活性位点，与PR活性相关的各种事件已被确定为新型PIs类别开发的目标。这些事件包括酶的二聚化、折叠机制以及PR的切割和非切割位点等。

Ritonavir-boosted monotherapy

HAART的引入是治疗HIV感染者的一项重大进步。然而，值得注意的是，超过20%的患者在开始HAART一年后不遵守其初始治疗方案。慢性治疗患者停用HAART的常见原因包括患者或医生的选择、经济负担、治疗失败和耐受性问题。这些耐受性问题可能包括与RT抑制剂相关的肾脏和心血管毒性、与依非韦伦相关的血脂异常以及与奈韦拉平相关的皮疹反应。在病毒完全抑制的HIV-1感染患者中，方案转换相对频繁。这种转换可分为主动转换，旨在规避潜在并发症或保留未来的治疗选择，或被动转换，发生在对耐受性差或其他问题的反应中。在各种可用的转换策略中，从联合治疗转换为利托那韦增效的PI单药治疗特别有吸引力，因为其潜在优势包括与HAART相比，方案复杂性降低、毒性降低和成本更低，同时仍允许保留其他药物类别用于未来治疗。一些报告表明，达芦那韦/利托那韦单药治疗有效抑制了HIV复制，不良事件发生率可忽略不计；具体而言，87%的患者病毒载量低于50 copies/mL，而只有4.99%的患者病毒载量超过200 copies/mL。

NRTIs被广泛认为与胰岛素抵抗风险增加、继发性血脂异常以及脂肪营养不良或萎缩相关。NRTI诱导的代谢毒性，包括血脂异常和胰岛素抵抗，可能显著导致各种长期合并症，如冠状动脉疾病(CAD)和心肌梗死(MI)。这些情况在接受HAART的HIV患者中观察到的频率增加。脂肪营养不良在30-50%的HIV感染者中观察到，并且似乎与特定的NRTIs相关。包含司他夫定或齐多夫定的方案已被证明是发生这种情况的最高风险。骨矿物质密度(BMD)降低和肾功能损害也可能与某些HAART方案相关。几项研究已经确定了替诺福韦的使用与HIV感染患者的肾小管功能障碍之间的相关性。在严重情况下，患者可能发展为范可尼综合征或急性肾损伤；然而，这种情况仅限于少数个体。相反，亚临床肾小管功能障碍明显更常见。此外，某些NRTIs由于其高中枢神经系统(CNS)穿透效力，已显示出对脑组织和神经元产生不利影响的潜力。

accumulating evidence indicates that boosted PI monotherapy may provide a potential safety benefit. Research has demonstrated that boosted PI monotherapy utilizing lopinavir/ritonavir or darunavir/ritonavir is not linked to the limb fat loss commonly associated with certain NRTIs. Transitioning to PI monotherapy may improve renal disease associated with tenofovir use, particularly in patients experiencing a more rapid decline while on tenofovir therapy. No adverse effects on BMD have been observed following the transition to boosted PI therapy. Negredo et al. found that monotherapy with ritonavir-boosted PIs, specifically lopinavir/ritonavir and darunavir/ritonavir, administered over one, two or three years, results in the stabilization of BMD in HIV-infected patients who have achieved long-term virological suppression. The implementation of boosted PI therapy may reduce certain CNS toxicities linked to combination therapy, as both lopinavir/ritonavir and darunavir/ritonavir exhibit lower cumulative patient exposure (CPE) scores in comparison to triple therapy regimens.

Although several trials investigating boosted PI therapy have yielded promising results, demonstrating reduced toxicities and only marginally lower efficacy compared to combination therapy, further large-scale studies are essential to evaluate the long-term efficacy, tolerability of treatment, and effectiveness in CNS and genital reservoirs. Currently, the European AIDS Clinical Society (EACS) guidelines acknowledge ritonavir-boosted PI monotherapy, specifically with twice-daily lopinavir/ritonavir or once-daily darunavir/ritonavir, as a viable option for patients who exhibit intolerance to NRTIs. The 2011 guidelines issued by the United States Department of Health and Human Services (USDHHS) do not endorse the use of PI monotherapy outside of a clinical trial context.

Multiple drug resistant mutations associated with PIs

在药物疗法施加的选择压力下，耐药病原体的进化是一个有充分记录的现象。HAART和PI单药治疗的临床疗效受到HIV-1耐药变体的快速出现及其随后传播的显著限制。据估计，北美和欧洲约10%的新发HIV感染与耐药突变有关。大多数批准的抗逆转录病毒药物，包括PIs，都因HIV中出现耐药突变而面临重大挑战。确定预防或减轻HIV突变率的策略是一个相当大的挑战，因为病毒可以在PR基因内积累多个突变，这些突变阻碍PIs与PR酶的结合。值得注意的是，超过50%的PR残基在各种组合中表现出有助于耐药的突变。通常，PR基因内的突变可分为两种不同类型：发生在PR酶活性位点内的突变和位于PR酶催化位点相当远距离的突变。活性位点内发现的主要突变包括D30N、G48V、I50L/V、V82A/F/T、I84V和L90M。几种主要的耐药突变已被确定为特定PIs的特征性标志。

近乎，PR单体中99个氨基酸位置中的37个是不变的，突变频率低于0.5%，而17个位置被描述为自然多态性。特定基因座的自然多态性被认为影响耐药性的机制和/或障碍。序列多态性已被证明影响PR活性、抑制剂的结合亲和力以及抑制剂耐药性的潜在机制。近似地，已确定45个位置与耐药相关。其中，发现26个位置显著降低对一种或多种PIs的敏感性。与PIs耐药相关的发生在活性位点外的重要突变已总结。这些底物切割位点最常见的耐药相关突变位于NC-p1和p1-p6切割区域。PR突变和底物切割位点的共同进化显著促进了PIs耐药性的发展。研究证明，当与PR基因中的耐药突变同时发生时，Gag切割位点的突变显著增加了对PIs的耐药性。从对PIs表现出耐药性的患者分离的HIV毒株的证据表明，发生在Gag底物切割位点附近或远处的突变也在赋予耐药性方面发挥作用。对赋予PIs耐药的切割位点突变的全面分析是可获得的。研究表明，RT酶内的突变导致PR的错误折叠和不当切割。

MDR HIV-1 PR变体（如MDR769）的出现归因于病毒基因组内突变的积累。此外，HIV-1 PR的另一个变体，具有20个突变（称为PR20），证明在PIs存在下能有效处理多蛋白。PR20与底物类似物共结晶的结构显示了柔性瓣膜的三种不同构象。突变型PR通过各种突变组合减少了与PIs的相互作用。研究人员确定了两种不同的开放构象，以及与PI结合的闭合构象相关的扩展结合位点。这些发现可能为修饰旨在对抗高度耐药变体的PIs提供有价值的见解。PR20已与PI安普那韦以及两种研究性PIs GRL-02031和GRL-0519一起进行研究。研究结果表明，与天然酶相比，临床抑制剂对突变酶的活性降低了1000倍以上。

PR基因中的突变影响PIs在切割多蛋白之外的阶段的剂量反应曲线。PR序列中的耐药突变改变了PIs的进入和进入后剂量反应曲线。临床观察到一个有趣的现象是，在接受含PI治疗经历病毒学失败的患者特定分离株中，PR基因没有突变。这些HIV变体被归类为对PIs敏感，因为它们在PR基因内没有突变，然而它们对药物保持耐药性。这种耐药性归因于包膜基因的突变，而不是PR基因本身。值得注意的是，PIs抑制病毒进入的功效被导致gp41提前终止的单点突变显著损害。研究表明，未切割的Pr55^Gag多蛋白与gp41的胞质尾区(CT)之间的相互作用阻碍未成熟病毒粒子的融合。研究证明，gp41 CT区域的突变赋予对PIs的耐药性。具有这些突变的HIV毒株在当前耐药检测试验中被归类为野生型；然而，这些病毒对PIs表现出耐药性。对PI药物耐药性的准确评估需要对包膜基因进行遗传分析。

最近一项研究通过PIs（安普那韦、茚地那韦、奈非那韦、利托那韦和沙奎那韦）的相互作用，重点了解了野生型和D30N/L76V突变型HIV PR的变化。安普那韦和奈非那韦带正电荷的–NH₂和噻唑基团受到D30N突变体中Asn30残基的静电排斥。分子动力学(MD)模拟显示，安普那韦、奈非那韦和沙奎那韦与L76V突变型PR相容性良好，而茚地那韦受此突变不利影响。由于L76V突变体不与这些药物建立直接相互作用，抑制剂与PR活性位点、瓣膜结构域和底物结合区残基的强结合足以抵消L76V介导的耐药性。

Development of novel class of PIs is needed

尽管几种美国FDA批准的PIs已用于艾滋病的临床实践，但PR耐药的复杂性显著降低了这些药物的疗效。新型PIs的开发对于HIV感染的治疗至关重要，并且已经进行了大量临床试验来推进这些新PIs。具体而言，新型HIV-1 PIs，包括H17、JW41、JW33和JW46，已被评估为潜在的抗HIV治疗药物。具有烯胺-oxindole取代基的新PIs已被设计和合成，以增强与孕酮受体(PR-配体)的相互作用。一系列六氢呋喃吡喃醇衍生的PIs已被设计、合成和评估。

PIs通常是抑制酶活性的底物类似物。除替拉那韦(TPV)外，所有FDA批准的PIs都被归类为拟肽物，它们竞争性地结合PR的活性位点。这些PIs基于过渡态模拟概念设计，并共享几个关键结构特征。值得注意的是，它们拥有一个仲羟基，作为天然底物中发现的P1羰基部分的替代物；该基团在与催化天冬氨酸残基Asp25和Asp25′的相互作用中起关键作用。此外，PI-PR复合物内的保守水分子促进PR中Ile50和Ile50′的酰胺基与PIs中P2和P1′的羰基氧原子之间的相互作用。仲羟基的存在对于有效的PI结合至关重要。利用各种苯基恶唑烷酮P2配体与羟乙胺核心一起设计和合成了新型PIs。这些化合物的抗病毒活性和结合亲和力受P2和P2′位置不同苯基取代的显著影响。具体而言，在P2位置含有2-和4-取代苯基恶唑烷酮的PIs表现出比具有3-取代的PIs更低的结合亲和力。相反，具有3-取代P2部分的PIs显示出有前景的抗病毒活性，强调了取代位点的关键作用。因此，建议进一步优化这些化合物。

已批准PIs的修饰代表了开发新型PIs的直接途径。合成了奈非那韦和沙奎那韦的类似物，这些类似物结合了具有不同取代模式的新噻吩环。值得注意的是，通过亚甲基与核心分离的噻吩基的类似物显示出对PR的显著活性。此外，其中两种化合物对两种经常遇到的突变体有效。此外，还合成了达芦那韦的类似物，其中包括一个取代的双-THF环作为P2配体，并随后进行了评估。

拟肽PIs是治疗艾滋病的重要治疗剂。利用四种新型二羟基乙烯等排体，特别是Phe-Pro和Pro-Pro二肽，合成了新的PIs，并随后评估了它们的生物活性。抗病毒试验表明，新开发的Phe-Pro二羟基乙烯等排体可能作为设计强效PIs的有前景的核心单元。从6,8-二氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷拟肽支架数据库中鉴定出IC₅₀值在亚微摩尔范围内的药理学干预候选物。

许多举措已经着手开发通过引入环状支架来减少肽性质的创新肽抑制剂，旨在增强药代动力学和药效学特性。已引入中心环状支架以取代传统的二肽