《Bioresource Technology》：Enhanced
d-mannose production by rational engineering of cellobiose 2-Epimerase
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本研究通过结构指导工程改造高温纤维素酶Caldicellulosiruptor saccharolyticus的cellobiose 2-epimerase（CsCE），获得三突变体E174A/L187M/R300K。该突变体在75℃、500g/L葡萄糖浓度下实现21.1%的转化率，较野生型提升35.7%。分子动力学模拟表明，E174A和R300K通过盐桥重构刚性化柔性环，增强热稳定性，而L187M稳定催化残基H188，提升底物结合效率。该成果为工业级高温高效葡萄糖异构酶开发奠定基础。
王胜|卢梦伟|刘天宇|李志豪|黄艳|严正飞|刘展志|吴静|夏伟
江南大学生物技术学院及教育部工业生物技术重点实验室，中国无锡214122
摘要
将葡萄糖转化为甘露糖是一种具有巨大经济价值和工业前景的生物转化途径。Caldicellulosiruptor saccharolyticus（CsCE）中的纤维二糖2-差向异构酶能够在相对较高的温度下催化这一反应过程，具有较高的底物溶解度和抗微生物污染等优点，但不幸的是其转化率较低（约15.5%）。在本研究中，我们通过结构导向工程获得了一种新的三重突变体E174A/L187M/R300K。在75°C下反应3小时后，其转化率达到21.1%，比野生型提高了35.7%。分子动力学分析表明，E174A和R300K诱导了盐桥重排，使柔性环变得更为刚性，从而增强了热稳定性；而L187M稳定了催化残基H188，改善了底物结合能力。这些发现阐明了CsCE的结构-功能关系，并为进一步的工业优化提供了基础。总体而言，本研究表明结构导向的理性工程是提高嗜热纤维二糖2-差向异构酶性能的有效策略，同时也为低成本、稳定的甘露糖工业生产提供了一种新的候选催化剂。
引言
d-甘露糖是d-葡萄糖的C-2位差向异构体，同时也是d-果糖的醛糖异构体。其甜度相当于蔗糖的60%和葡萄糖的86%，在食品加工领域具有很大的应用潜力（Hua等人，2021年；Scaglione等人，2021年；Wang等人，2022年）。此外，它还具有多种健康益处，包括促进胰岛素分泌、预防尿路感染、调节免疫系统以及改善肠道环境以促进益生菌增殖（Adachi等人，2022年；Chen等人，2024年；Cooper等人，2022年；Dhanalakshmi等人，2023年；Gu等人，2023年；Nan等人，2022年；Sharma等人，2018年；Wei等人，2020年）。由于其独特的性质和广泛的应用，d-甘露糖受到了广泛关注。
不断增长的市场需求推动了d-甘露糖生产技术的发展，其中酶法因其温和的反应条件和环保性而成为研究焦点。因此，利用以d-葡萄糖或d-果糖为底物的异构酶进行d-甘露糖的生物转化具有巨大的生产潜力（Wang等人，2022年；Wu等人，2019年）。目前，已报道的能够生产d-甘露糖的异构酶主要有：d-甘露糖异构酶（MIase，EC 5.3.1.7）（Adachi等人，2022年；Hua等人，2021年；Wu等人，2022年）、d-甘露糖2-差向异构酶（MEase，EC 5.1.3.-）（Ni等人，2024年；Saburi等人，2019年）、d-木酮糖异构酶（LIase，EC 5.3.1.15）（De Rose等人，2021年；Guo等人，2019年；Wu等人，2020年）以及纤维二糖2-差向异构酶（CEase，EC 5.1.3.11）（Park等人，2011年）。如图S1所示，MIase和LIase以d-果糖为底物，而MEase和CEase则以d-葡萄糖为底物合成d-甘露糖（见补充材料，图S1）。
从原材料成本的角度来看，使用d-葡萄糖作为底物生产d-甘露糖比使用d-果糖更具优势。在该领域之前的研究中，Park等人（2011年）首次发现Caldicellulosiruptor saccharolyticus中的纤维二糖2-差向异构酶（CsCE）可以催化d-葡萄糖向d-甘露糖的转化；当d-葡萄糖底物浓度为500?g/L时，转化率约为15.5%。随后，Saburi等人（2019年）从Runella slithyformis和Dyadobacter fermentans中分离出两种MEase，在相同的500?g/L d-葡萄糖底物条件下，这两种MEase的转化率分别达到了24.4%和22.8%。此外，Ni等人（2024年）从Cytophagaceae家族的细菌中分离出另一种MEase，在使用100?g/L d-葡萄糖作为底物时，转化率为23.1%。然而，这些MEase通常在较低的中温（40-50°C）下运行，这不利于工业生产。较高的温度有利于大规模工业生产，因为它们可以提高反应速率、改善底物溶解度和传质效果、简化下游分离过程并防止微生物污染（Che Hussian & Leong，2023年）。因此，Caldicellulosiruptor saccharolyticus中的纤维二糖2-差向异构酶（CsCE），其最佳工作温度为75°C，是一个有前景的工业应用候选者。然而，其实际应用受到转化率较低的制约，这促使我们进行了本次工程改进。
因此，本研究聚焦于CsCE，并对其进行了蛋白质工程改造，得到了突变体E174A/L187M/R300K。在相同条件下，该突变体生产d-甘露糖的转化率从野生型的15.5%提高到了21.1%。同时，从动力学、半衰期测定和分子动力学（MD）模拟的角度揭示了其性能提升的分子机制：关键环的柔韧性降低增强了酶的热稳定性，而187位点的替换保持了催化残基的正常构象。这项研究为未来提高CEase的催化效率和增强MEase的热稳定性提供了理论基础，最终有助于开发适合工业应用的突变酶。
部分内容摘录
化学品、质粒和菌株
2?×?Phanta Flash Master Mix购自Vazyme Inc.（中国南京）。Plasmid Mini Small Extraction Kit购自TianGen Biotech Co.Ltd.（中国北京）。重组质粒pET-24a(+)-csce（带有His标签）由Azenta Inc.（中国苏州）合成，该质粒编码CsCE基因（WP_011915904.1）。Escherichia coli JM109和BL21(DE3)的感受态细胞分别作为克隆宿主和表达宿主，并储存在我们的实验室中。
野生型CsCE及其突变体的表达和纯化
已确认的质粒...
表达、纯化和酶学特性分析
CsCE在宿主菌株E. coli BL21(DE3)中成功实现了异源表达。纯化的CsCE的SDS-PAGE分析显示出一个单一的均一条带，分子量约为47?kDa（图1A）。Kim等人（2006年）的先前研究表明，异构酶催化反应的平衡转化率通常约为33%。为了尽量减少平衡转化对酶活性评估的影响，提高了底物浓度...
结论
本研究报道了对来自C. saccharolyticus的嗜热纤维二糖2-差向异构酶进行理性工程改造，得到了一个三重突变体（E174A/L187M/R300K），其在以廉价底物葡萄糖生产d-甘露糖方面的催化性能得到了提升。在酶用量为1.5?mg/mL时，该工程变体的转化率为21.1?±?0.4%，比野生型酶（15.5?±?0.2%）提高了35.7%。尽管这一数值仍低于已报道的最高转化率...
CRediT作者贡献声明
王胜：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，验证，软件使用，方法学设计，实验设计，数据管理。卢梦伟：方法学设计，数据管理。刘天宇：数据可视化，验证，数据管理。李志豪：验证，实验设计，数据管理。黄艳：资源获取。严正飞：资源获取，数据管理。刘展志：数据可视化，资源管理。吴静：项目监督，资金筹集，正式数据分析。夏伟：撰写 – 审稿与编辑，
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
