《Frontiers in Molecular Biosciences》：Advances in protein dot blot: principles, technical specifics, applications, and future perspectives
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蛋白质斑点印迹（Protein Dot Blot）是一种高效的免疫印迹技术，可在无需电泳的情况下实现蛋白质的定性/半定量分析，其核心依赖于抗原-抗体结合。该技术的流程包括将样品直接点在膜上进行封闭、抗体孵育及信号检测，整个实验可在3-5小时内完成。其优势在于操
蛋白质斑点印迹（Protein Dot Blot）是一种高效的免疫印迹技术，可在无需电泳的情况下实现蛋白质的定性/半定量分析，其核心依赖于抗原-抗体结合。该技术的流程包括将样品直接点在膜上进行封闭、抗体孵育及信号检测，整个实验可在3-5小时内完成。其优势在于操作简单、通量高、兼容微量样品且成本低廉，可支持基础生命科学研究及临床检测。然而，该技术仍面临动态范围窄、无法分辨蛋白变体、易受非特异性结合影响以及对操作变量敏感等局限性。本综述系统阐述了其原理与操作流程，分析了影响灵敏度及重复性的关键因素，并重点聚焦于近期在蛋白质分析、临床生物标志物检测及食品安全领域的应用进展与技术革新。旨在为研究人员提供全面的参考及进一步优化的理论基础，未来的发展可能涉及基于纳米材料的信号放大、工程化抗体，以及与微流控或质谱技术的整合，以拓展其在生物医学及公共卫生领域的效用。
1 引言
蛋白质是生物学过程的关键执行者，其表达谱对于解析疾病机制及识别生物标志物或治疗靶点至关重要。准确、高通量的蛋白质检测对于揭示生理/病理作用至关重要，然而传统的基于抗体的方法（如Western印迹（WB）和酶联免疫吸附试验（ELISA））存在固有的局限性。WB虽然是实验室研究中鉴定目标蛋白的常用工具，但耗时较长，单次实验处理的样本数量有限，且步骤繁琐，导致难以在一次实验中处理所有收集的样本。ELISA虽然通过微孔板形式提供了定量优势和较高通量，但其依赖于孔内的固相吸附，可能引入蛋白结合效率的差异。因此，需要能够在不牺牲特异性和灵敏度的情况下实现高通量蛋白鉴定的新方法。蛋白质斑点印迹（Dot Blot）作为一种替代策略应运而生，它消除了蛋白分离的步骤，同时减少了样品和抗体的用量。该技术类似于ELISA，但使用硝酸纤维素（NC）或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜进行蛋白固定，而非标准孔板，从而实现目标蛋白的定量检测。该方法具有快速、高通量分析多个样本的独特实验优势，规避了SDS-PAGE中典型的劳动密集型蛋白分离步骤，不仅缩短了检测时间，还最大限度地减少了珍贵样品和试剂（包括抗体）的消耗，特别适用于处理有限的生物材料。此外，该方法具有强大的定量能力，信号强度与目标蛋白浓度具有良好的相关性，使其成为一种经济高效、快速可靠的蛋白质分析工具。
2 蛋白质斑点印迹技术原理
蛋白质斑点印迹是一种用于目标蛋白定性检测和半定量分析（Semi-quantitative analysis）的免疫印迹试验。从根本上说，它与WB共享相同的核心原理：即抗原（目标蛋白）与抗体之间的特异性结合，这是从复杂的生物样品中选择性识别和捕获目标蛋白的分子基础。与WB不同，后者需要按大小对蛋白质进行电泳分离，然后将蛋白条带从凝胶转移到膜上，斑点印迹完全绕过了这些步骤。取而代之的是，将含有目标蛋白的样品直接点在固体膜上，通常是NC或PVDF膜。这些膜对蛋白质具有高亲和力，允许它们通过疏水相互作用和静电力不可逆地结合到膜表面，将蛋白质固定在样品点样的位置。固定后，膜经过标准的免疫检测步骤以可视化目标蛋白。首先封闭膜以最小化非特异性抗体结合和背景噪声，然后与针对目标蛋白的一抗孵育。洗涤去除未结合的一抗后，加入标记的二抗（结合辣根过氧化物酶（HRP）或荧光染料），形成可检测的免疫复合物。最后，底物引发产生信号的反应（由酶催化或通过荧光），信号的存在表明目标蛋白的存在，信号强度反映相对丰度——通过光密度测定法或视觉评估实现半定量分析。这种直接且简化的工作流程促进了快速读出，结果比传统WB显著更快，并且通过在单张膜上并行分析数十甚至数百个样本实现了高通量筛选。因此，蛋白质斑点印迹技术利用抗原-抗体的特异性、固相固定化和通过标记偶联物进行的信号放大来有效检测特定蛋白质，使其成为研究、诊断和蛋白质分析中的宝贵工具，特别是在需要快速确认蛋白表达或高通量样本筛选的场景中。
3 蛋白质斑点印迹分析的实验程序
3.1 样品制备
根据实验要求从适当来源提取蛋白质。例如，组织匀浆或细胞沉淀经裂解（通常使用裂解缓冲液并可选超声处理）以获得总蛋白提取物；培养上清液、血清、尿液或其他液体样品可直接使用或适当稀释。为防止蛋白水解，提取过程中需加入蛋白酶抑制剂（如苯甲基磺酰氟（PMSF））。使用BCA或Lowry等方法测定蛋白浓度，确保样品调整至最佳浓度以便点样。
3.2 印迹膜选择与制备
选择合适类型的膜，即NC或PVDF膜，并切割成所需尺寸。对于PVDF膜，需用无水甲醇浸泡活化直至外观均匀半透明，随后用去离子水短暂冲洗并在缓冲液中平衡。NC膜不需要甲醇活化，直接用去离子水或缓冲液润湿即可。标记膜的角落（例如在左上角切一个缺口）以指示方向，便于后续斑点定位。然后将膜平铺在干净、坚硬的表面（如玻璃或塑料板）上，确保无气泡接触。
3.3 样品加载与固定
将制备好的蛋白质样品以点状形式施加，并包含适当的对照以验证测定的特异性和定量可靠性——具体而言，阳性对照（已知目标蛋白或经验证的阳性样品）和阴性对照（无蛋白样品）。点样后，室温风干或在烘箱中干燥，注意避免过热诱导的蛋白质变性或膜损伤。干燥通过疏水和静电相互作用增强了蛋白质在膜上的稳定吸附，防止在后续步骤中洗脱并确保信号稳定性。
3.4 封闭与抗体孵育
使用合适的封闭液阻断膜上的非特异性结合位点，常用的选择包括溶解在PBST缓冲液中的脱脂奶粉或牛血清白蛋白（BSA）；此步骤对于最小化背景噪声至关重要。去除封闭液后，进行一抗孵育，随后洗涤以去除未结合的一抗。接着加入结合酶（如HRP）或荧光团的二抗，物种兼容性确保其与一抗特异性结合。二抗孵育后的额外洗涤进一步降低了非特异性信号。
3.5 信号检测
检测策略根据二抗标记物进行定制。酶标二抗利用化学发光底物，通过成像系统或X射线胶片捕获信号。荧光标记二抗则使用荧光成像设备观察，实现斑点信号的直接定量。蛋白质斑点印迹的核心流程包括连续的关键阶段：样品制备、印迹膜准备、样品加载、封闭、抗体孵育和信号检测。与传统WB不同，该技术消除了凝胶电泳和膜转移等中间步骤，实现了简化的样品处理和检测。这种效率使得蛋白质斑点印迹成为大样本队列高通量筛选的最佳选择。
4 蛋白质斑点印迹的关键技术点与注意事项
4.1 斑点印迹膜的选择
NC和PVDF膜是生化分析中常用的两种膜。NC膜具有成本效益，呈多孔网状结构，典型孔径为0.45 μm或0.22 μm，蛋白结合能力约为80-150 μg/cm2，经缓冲液润湿后即可直接使用。然而，NC膜的一个显著局限性在于其相对脆性，在处理过程中容易撕裂。相比之下，PVDF膜表现出优异的机械强度，包括增强的抗撕裂性、化学稳定性和高机械强度。此外，它们提供更高的蛋白结合能力，通常在100-200 μg/cm2范围内。PVDF膜特别适用于低丰度蛋白或含去污剂样品的应用，因为它们倾向于以更高的亲和力保留蛋白质。对于高丰度目标蛋白（如β-肌动蛋白或GAPDH等管家蛋白）且有充足样品时，NC膜通常足够并产生强信号。相反，对于低丰度靶标（如某些信号蛋白或转录因子）或样品量有限时，通常首选PVDF膜，因其能实现更高的捕获效率和更强的信号强度。
4.2 样品浓度与点样体积
样品中的蛋白浓度和点样体积都是需要系统优化的关键参数。微调这两个因素不仅直接影响斑点形态的一致性，还决定了信号强度是否与蛋白浓度呈线性相关。当蛋白浓度超过膜的结合能力时，膜表面的可用结合位点迅速饱和；多余的蛋白质无法形成稳定的相互作用，会随点样溶液向外扩散。这种扩散会导致形成边缘模糊的扩大斑点。极端情况下，持续的扩散会导致相邻斑点重叠，从而引起信号交叉污染。相反，当蛋白浓度低于膜的有效捕获阈值时，斑点的分子密度不足以支持有效结合。在这种情况下，增加点样体积并不能提高可检测性。对于低丰度蛋白，过度稀释的样品进一步加剧了实验变异性并降低了重复测定的重现性。因此，实施初步滴定实验势在必行，通过评估一系列样品稀释度和点样体积，研究人员可以在定义的范围内建立信号强度与蛋白浓度呈线性关系的优化条件。
4.3 封闭液的选择
常见的封闭试剂包括脱脂奶粉和BSA。脱脂奶粉通常以5%的浓度用于含吐温-20的PBS（PBST）中，具有成本效益且通常表现出良好的封闭效力。然而，其酪蛋白成分会干扰磷酸化蛋白的检测：酪蛋白本身是一种磷酸化蛋白，可能会非特异性地结合抗磷酸化抗体，从而提高背景信号。在此类情况下，通常优选使用3%-5% BSA溶于PBST，因为它缺乏磷酸化位点，从而最大限度地减少交叉反应。最终，封闭缓冲液的选择应基于其与抗体和目标蛋白的兼容性来确定。
4.4 抗体稀释比例与洗涤优化
一抗和二抗的最佳稀释度平衡了特异性信号强度和背景噪声。稀释不足（抗体浓度不足）导致抗原结合不佳，产生弱信号或假阴性。相反，过高的抗体浓度会促进与无关样品成分的非特异性结合，增加背景干扰并掩盖真实信号。为了确定最佳稀释度，应系统地评估一系列抗体浓度。理想的稀释度定义为在产生明显、目标特异性信号且背景可忽略的条件下。因此，严格优化抗体稀释比例对于确保斑点印迹结果的重现性和准确性至关重要。
4.5 洗涤条件
每次孵育之间的彻底洗涤对于降低背景和提高信噪比至关重要。洗涤不充分可能导致残留未结合或松散结合的抗体，从而导致非特异性信号的产生。推荐的方案是在每次抗体孵育后至少洗涤膜三次，每次洗涤约5分钟。这些洗涤应使用足量的洗涤缓冲液以确保膜完全浸没，并辅以温和的振荡以促进松散结合成分的去除。除了上述关键因素外，许多操作细节也会影响斑点印迹结果的一致性。例如，点样过程中膜的湿润状态至关重要：点样过程中膜区域的不均匀干燥会导致施用的样品液滴行为异常。这种不规则性可能表现为“甜甜圈状”斑点，特征是边缘信号集中而中心减弱，这是由于部分吸收后液滴渗透突然停止所致。为了缓解这一问题，必须在整个点样过程中保持膜处于均匀湿润的状态，并迅速进行操作，防止微液滴在完成吸收前蒸发。此外，点样技术本身，特别是施用的稳定性和速度，也会影响斑点形态；点样过慢会促进样品的过度扩散或不均匀干燥。孵育参数，包括温度和温和振荡，必须跨实验标准化以确保重现性。总之，斑点印迹技术高度依赖于严格的标准化方案。微小的操作偏差都可能导致结果出现不成比例的巨大变化。为了获得可靠的数据，研究人员必须严格遵守优化后的程序，并在膜制备、点样、封闭、抗体孵育和洗涤的所有阶段保持一致的条件。对这些细节的细致关注是实现斑点印迹结果高重复性和强置信度的基石。
5 蛋白质斑点印迹的优势与局限性
5.1 优势
首先是广泛的样品适用性。斑点印迹技术在适应多样化的样品类型和来源方面表现出显著的通用性。它与复杂的生物混合物兼容，包括细胞或组织裂解液、血清、血浆、尿液、脑脊液、细胞培养上清液以及其他生物流体或提取物。与WB不同，WB要求样品相对纯化且可溶，斑点印迹对蛋白溶解度和样品纯度的变化具有耐受性，能够处理顽固或低丰度蛋白。相比之下，ELISA容易发生蛋白损失和变性，限制了其对蛋白产量充足样品的适用性。其次是操作效率：简单、快速且具有成本效益。斑点印迹通过整合简便性、快速周转和成本效益展示了卓越的操作效率。与通常需要数天完成的WB不同，斑点印迹通过消除电泳和转移步骤简化了工作流程，使测定在数小时内完成。这种效率使其成为高通量筛选和时间敏感型分析的理想选择。此外，斑点印迹无需昂贵电泳设备和相关试剂，总体成本显著低于WB。虽然ELISA也提供高通量，但斑点印迹在操作简便性和成本效益方面表现更佳。简化的方案还降低了技术门槛，便于新手用户采用，并确保在单张膜上并行分析数十至数百个样本时结果一致。第三是极少的样品需求量。斑点印迹测定每点仅需微升级体积或纳克量的蛋白质，这一特性在处理有限的生物材料（如细胞裂解液、活检组织或罕见临床标本）时具有显著优势。这种最小的输入要求不仅保留了珍贵的样品用于重复分析或互补实验方法，还促进了在单张膜上对多个样本的平行评估。相比之下，WB每条泳道需要10-30 μg蛋白质并依赖电泳分离，无法满足单细胞裂解液等微量样品的需求。尽管ELISA提供高通量，但它需要每孔50-100 μL样品和纳克至微克级蛋白质；此外，固相吸附经常导致蛋白损失，需要更高的样品输入进行补偿。通过实现直接膜固定而无须分离，斑点印迹保留了珍贵样品用于重复测定或互补分析，同时促进多个样品的并行检测。第四是高可检测性。斑点印迹测定表现出高可检测性，当与高亲和力抗体结合时，可实现皮克级灵敏度，其性能可与WB相媲美。值得注意的是，它仅使用约60 ng总蛋白即可检测到低至0.19 ± 0.04 pmol的蛋白羰基，而WB每条泳道需要10-30 μg（高出100-1000倍），使其不适合稀缺样品。与ELISA相比，其灵敏度在皮克至纳克水平波动，且受固相吸附引起的蛋白损失/变性影响，斑点印迹能够实现NC/PVDF膜上的直接固定，确保在复杂基质中具有优越的实际可检测性。例如，金纳米颗粒放大的斑点印迹在脑脊液中检测到50 pg/mL的阿尔茨海默病相关Aβ1-42，优于商业ELISA试剂盒（100-200 pg/mL）。
5.2 局限性
尽管在快速定性和半定量分析中具有优势，斑点印迹由于其简化的工作流程和操作原理而存在固有的局限性。斑点强度与蛋白浓度之间的关系仅在有限范围内呈线性。在高蛋白水平下，斑点可能饱和，无法反映成比例的浓度增量，而在检测阈值附近，信号可能与背景噪声难以区分。这种狭窄的动态范围损害了该技术精确量化的可靠性。此外，由于蛋白质是直接施加到膜上而没有电泳分离，该方法无法分离相似分子量的蛋白质、不同亚型或翻译后修饰。例如，磷酸化与非磷酸化变体、全长蛋白与裂解产物或活性与非活性构象将产生合并的信号，掩盖分子异质性。另一个关键限制是非特异性结合的风险。由于斑点印迹完全依赖抗体的特异性，在复杂基质（如含有数千种蛋白质的血清或组织匀浆）中与无关蛋白的交叉反应性可能产生假阳性信号，使结果解释复杂化。该技术还对实验操作变量高度敏感。点样体积、移液速度、膜水合状态或洗涤效率的波动都会深刻改变斑点形态，阻碍跨实验运行或实验室的重现性。如果上样过慢，可能会在膜吸收之前导致部分液滴蒸发，导致“空心斑点”，边缘强烈而中心减弱。同样，膜润湿不均匀会引起不规则的蛋白质扩散，导致斑点形状不一致。过度洗涤可能会去除仅松散结合在膜上的目标蛋白，而洗涤不足可能会增加背景噪声。此外，大型蛋白复合物可能无法有效地结合到膜基质中，高度疏水的蛋白质可能在点样过程中聚集或沉淀。值得注意的是，缺乏电泳分离排除了利用电泳迁移率推断目标蛋白的分子量、等电点或其他物理化学性质的可能性，也无法提供关于结构状态的见解，如裂解、寡聚化（例如二聚体或多聚体形成）或构象变化。因此，对于需要详细蛋白质表征的研究，斑点印迹不能替代WB或其他高分辨率方法。相反，其实用性最好局限于快速定性筛选和半定量比较，对于要求精确定量、复杂样品分析或机制调查的应用，需要补充ELISA、WB或质谱等方法。
6 蛋白质斑点印迹的应用
6.1 基础研究应用
在重组蛋白分析方面，蛋白质斑点印迹是快速筛选重组蛋白表达中最普遍和最宝贵的（prevalent and invaluable）技术之一。传统上，验证克隆基因产物的表达（如在Escherichia coli或培养细胞中）通常需要运行多个SDS-PAGE凝胶后进行WB。斑点印迹在高通量筛选中具有特别的优势，可以在单张膜上并排比较多个克隆或培养条件，如诱导时间、温度和诱导剂浓度。阳性克隆或有利条件产生强的免疫反应点，而阴性克隆则无信号，允许立即进行视觉辨别。斑点印迹的应用不仅限于常规重组蛋白；它还可以有效地用于检测分泌蛋白和膜蛋白。此外，该技术适用于评估病毒 multiplicity of infection（MOI）和感染持续时间等变量对蛋白表达的影响。在蛋白修饰和构象分析方面，对于蛋白修饰（如羰基化，关键的氧化应激生物标志物）的检测，斑点印迹比WB具有更高的灵敏度和更少的样品需求。斑点印迹仅使用纳克量的蛋白质即可实现皮摩尔级检测，而WB需要微克级的蛋白输入。蛋白羰基的测量可以通过与2,4-二硝基苯肼（DNPH）衍生化，然后用抗羰基抗体探测来实现。在此测定系统中，二甲基亚砜用作溶剂，能够有效从组织中提取蛋白质同时保持其溶解度。在这些优化条件下，检测限可达0.19 ± 0.04 pmol羰基，每个斑点仅需约60 ng蛋白质。这种高灵敏度使得即使在单个果蝇提取的样品中也能检测到氧化损伤，并且可以在单个PVDF膜上并行分析多个样品。在病毒蛋白研究中，斑点印迹利用表位特异性抗体监测生理或实验条件下的结构重排，促进了构象动力学的研究。在外泌体蛋白分析方面，外泌体是包裹在磷脂双层中的纳米级囊泡，广泛分布于血浆和尿液等生物流体中。在其脂质膜的屏蔽下，外泌体蛋白以其翻译后修饰形式表现出增强的稳定性，从而提供更精确地反映生理和病理状态。最近Hu及其同事开发了一种两亲超分子探针，能够从极小体积的临床样品中高效捕获外泌体。通过将这种探针涂覆在NC膜上，外泌体可以以阵列形式固定，这种设计不仅提高了通量，还规避了电泳转移步骤中常见的蛋白损失和变性。在临床验证研究中，研究团队分析了36名肝细胞癌患者和12名健康对照者的血浆样本，量化了PD-L1（公认的免疫治疗生物标志物）和Syntenin-1（经典的外泌体标记物）。值得注意的是，每个样品仅需1 μL血浆，且该测定显示出高灵敏度与极好的定量准确性。这些发现凸显了基于斑点印迹的外泌体阵列作为高通量液体活检的强大解决方案的潜力。在细菌蛋白检测方面，斑点印迹形式对病原体检测测定表现出高适应性，促进临床样本中微生物抗原或病原体特异性抗体的鉴定。其快速和操作简单使其在传染病诊断和流行病学筛查中特别有价值，特别是在资源有限的环境或高通量场景中。一个典型的例子是检测Salmonella enterica的不同血清型。传统基于培养的血清分型方法非常耗时，而斑点印迹已成为一种简化的替代方案。这种方法涉及将抗原提取物或血清型特异性抗体固定在膜上，然后用来自测试样品的相应靶分子进行探测。例如，针对SalmonellaO:9（血清型Enteritidis）和O:4（血清型Typhimurium）的特异性抗体可以共固定在膜上，从而在单一反应中实现对两种血清型的多重检测。在加标的鸡蛋样品中，这种斑点印迹测定显示出>90%的特异性，有效区分了S. Enteritidis与其他血清型和非沙门氏菌（如E.coli）。在禽类屠宰场进行的现场试验显示与传统文化方法的符合率约为85%，同时将检测时间从几天缩短至仅仅3-4小时。在寄生虫感染检测方面，弓形虫（Toxoplasma gondii）是一个典型应用领域。诊断通常依赖于检测阶段特异性抗体。一个关键的诊断标志物是致密颗粒抗原GRA8，它在宿主细胞入侵的早期阶段强力表达，但在慢性感染中下调。通过斑点印迹检测血清中的抗GRA8抗体可以区分急性和慢性弓形虫病。此外，Safarpour及其同事开发了一种基于纳米颗粒的斑点印迹测定，能够同时在患者标本中检测抗弓形虫IgM和IgG。使用集成壳聚糖-金纳米颗粒偶联物的三明治形式，该测定产生视觉上可辨别的斑点，即使在低抗体滴度下也保持高灵敏度。这些进步增强了斑点印迹技术在资源受限环境中的即时检测以及孕妇和免疫功能低下个体弓形虫病临床管理方面的价值。
6.2 临床样本分析
在神经退行性疾病生物标志物方面，斑点印迹已成为检测低丰度神经退行性疾病生物标志物（如阿尔茨海默病中的Aβ肽）的有前途的工具。Wang及其同事开发了一种用于Aβ1-42的金纳米颗粒放大斑点印迹免疫测定法。在这种方法中，结合金纳米颗粒的抗体用于放大膜上的信号，产生的检测限低至50 pg/mL。这一灵敏度水平与许多ELISA相当或更高。值得注意的是，该方法使用源自AD患者的脑脊液（CSF）样本进行了验证。鉴于CSF Aβ浓度与疾病状态之间存在公认的相关性，检测亚皮克级Aβ的能力为AD的早期诊断和监测治疗反应铺平了道路。在自身免疫性疾病的自身抗体筛选方面，斑点印迹提供了一种验证自身免疫性疾病中候选自身抗原的实用策略。在系统性红斑狼疮（SLE）中，诊断传统上依赖于多种自身抗体的检测，包括抗核抗体（ANA）、抗双链DNA和抗Sm抗体。为了探索新的生物标志物，利用斑点印迹分析研究了针对TCP1的自身抗体。将SF9细胞中表达的重组TCP1蛋白点在膜上，然后应用SLE患者、其他自身免疫性疾病个体（包括类风湿关节炎、系统性硬化症和Beh?et病）以及健康对照者的血清。斑点印迹结果显示，79%的SLE患者存在抗TCP1抗体，而在其他组中很少检测到。这对应于79%的诊断敏感性和90%的特异性。这些发现表明斑点印迹可有效用于验证TCP1自身抗体作为SLE特异性生物标志物。总之，该方法促进了血清针对候选抗原阵列的高通量筛选，并且在自身免疫性疾病的生物筛选中具有相当大的临床潜力。在癌症生物标志物检测方面，斑点印迹测定越来越多地被探索用于血液或组织提取物中肿瘤相关生物标志物的检测，为常规免疫测定提供了一种简单且可扩展的替代方案。此类应用在癌症筛查、诊断、治疗监测和预后评估中具有特殊价值。一个值得注意的例子是人表皮生长因子受体2（HER2），它是乳腺癌中关键的预测和预后因素。Tan及其同事利用斑点印迹测定量化乳腺癌患者血清HER2水平。结果显示血清HER2浓度与肿瘤组织HER2状态之间存在强相关性。这些发现表明斑点印迹可用于HER2监测，提供一种具有成本效益且高效的方法，可补充乳腺癌管理中现有的测定。斑点印迹测定也已应用于胆管癌（CCA），这是一种死亡率很高的恶性肿瘤，主要归因于缺乏可靠的非侵入性早期检测方法。Truong等人确定细胞因子诱导的凋亡抑制因子1（CIAPIN1）作为潜在的预后生物标志物，并使用斑点印迹测量159名CCA患者和93名健康对照者血清中的CIAPIN1水平。分析显示患者体内的CIAPIN1水平显著高于对照组。这些发现表明，检测CIAPIN1的斑点印迹可能有助于区分恶性和非恶性状态并提供有用的预后见解。另一个临床应用涉及胸苷激酶1（STK1），一种与细胞增殖密切相关的酶。在生理条件下，血清STK1浓度维持在低水平，而肿瘤发生通常导致其循环水平显着升高。Chen等人利用化学发光斑点印迹测定评估了大量队列（包括健康个体和疑似癌症患者）的血清STK1水平。该测定表现出优异的诊断性能，在既定的临床临界值下，对健康受试者和疑似癌症病例之间具有强大的区分能力。重要的是，这种高通量方法实现了人群规模筛查，区分了健康个体和癌症患者，涵盖肺癌、乳腺癌和结直肠癌等常见恶性肿瘤。与ELISA相比，斑点印迹方法被证明更具成本效益，适合大规模流行病学研究或常规健康检查。
6.3 食品安全检测
在食品级蛋白残留检测方面，食物过敏构成重大的公共卫生挑战，因为纯化的食品级氨基酸制剂中的残留蛋白污染物如果没有得到充分控制，可能会带来过敏风险。因此，检测和量化过敏原蛋白对于确保食品纯度和安全至关重要。一系列分析方法已被用于此目的，斑点印迹技术已成为一种特别有价值的方法，其特点是高灵敏度、操作简单和
