《European Journal of Pharmacology》：CRISPR/Cas9-based genome-wide screen reveals a synergistic effect of Irinotecan and USP1 inhibitor in colorectal cancer
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结直肠癌化疗耐药机制研究及USP1抑制剂协同治疗策略探索。通过全基因组CRISPR/Cas9筛选发现USP1调控伊立替康耐药，联合I-138与伊立替康显著抑制HCT-116等细胞增殖并降低IC50值，在裸鼠移植瘤模型中验证协同效应，机制涉及pCREB磷酸化及FANCD2/FANCI、PCNA等DNA损伤修复通路动态调控，RNA测序显示cAMP、PI3K-AKT、Wnt信号通路富集。
王磊|苗敏|鲍丽静|褚俊峰|周娟|宋文波|蔡佩佩|程晨|徐洪业|王涛|赵荣荣|王航|刘峰|徐明|田光宇
扬州大学附属江都人民医院肿瘤科，中国扬州江洲路100号，225200
摘要
伊立替康（Irinotecan）耐药性仍然是转移性结直肠癌（mCRC）治疗中的一个重大挑战。为了解决这一问题，我们通过全基因组CRISPR/Cas9筛选技术在HCT-116细胞中发现了USP1作为伊立替康的合成致死伙伴。将USP1抑制剂I-138与伊立替康联合使用于HCT-116、HT-29和SW620细胞系中，显著降低了IC50值，抑制了细胞增殖，并减少了菌落形成，显示出协同效应（组合指数CI<1）。这种协同治疗效果在异种移植小鼠模型中得到了进一步验证。机制研究表明，I-138显著上调了pCREB（Ser133）的活性，同时在DNA损伤反应和修复过程中动态调节了USP1、FANCD2/FANCI和PCNA的活性。RNA测序进一步显示，在组合组中cAMP、PI3K-AKT和Wnt通路显著富集，这些通路都与CREB的活性相关。这些发现表明，通过联合策略抑制USP1是一种克服伊立替康耐药性的有前景的方法，为CRC的治疗提供了新的途径。
引言
结直肠癌（CRC）仍然是一个严重的全球健康问题，晚期病例占初次诊断病例的50%以上，给患者家庭带来了巨大的经济和心理社会负担（Dekker等人，2019年；Eng等人，2024年；Jiang等人，2024年）。尽管治疗手段有所进步，但转移性CRC的5年生存率仍低于15%，这凸显了开发新型治疗策略的迫切需求（Eng等人，2024年）。DNA修复机制的紊乱是导致结直肠癌发生的基本生物学过程（Amodio等人，2024年）。作为主要的化疗药物，伊立替康通过稳定拓扑异构酶I-DNA复合物发挥其细胞毒性作用，从而引发致命的单链DNA断裂并触发细胞凋亡（Pommier，2006年；Gilbert等人，2012年）。尽管伊立替康被广泛用于晚期CRC的一线FOLFIRI和二线治疗方案（Van Cutsem等人，2011年），但其临床应用受到获得性耐药机制的严重限制，包括DNA损伤修复能力的增强、药物外排泵的过表达以及抗凋亡通路的激活（Mazard等人，2013年；Ma等人，2023年）。此外，严重的腹泻和骨髓抑制等剂量限制性毒性常常导致治疗中断（Goldberg等人，2004年；Lee等人，2024年），这凸显了需要开发耐药性逆转策略的必要性。最新研究表明，去泛素化酶（DUBs）在癌症进展和治疗耐药性中起着关键调节作用（Nijman等人，2005年；García-Santisteban等人，2013年）。其中，泛素特异性蛋白酶1（USP1）因其在DNA损伤反应和细胞周期调控中的双重作用而受到特别关注（Huang等人，2006年；Cohn等人，2007年；Rennie等人，2021年）。USP1通常与UAF1形成功能性复合物，通过FANCD2/FANCI的去泛素化调节Fanconi贫血（FA）通路，并通过PCNA修饰控制转录合成（Murai等人，2011年；Olazabal-Herrero等人，2015年；Xu等人，2019年），从而使USP1能够保护癌细胞免受基因毒性损伤。在BRCA缺陷的乳腺癌/卵巢癌中，抑制USP1可诱导合成致死性（Lim等人，2018年；Ma等人，2019年；Simoneau等人，2023年；da Costa等人，2024年；Torrado等人，2025年）。最近的临床前研究进一步验证了USP1在非小细胞肺癌中的治疗潜力（García-Santisteban等人，2013年；Dexheimer等人，2014年；Tyagi等人，2022年）。值得注意的是，伊立替康耐药性常常与DNA修复能力的增强相关（Pommier，2006年；Gilbert等人，2012年），这表明这一过程可能受到USP1活性的调控。我们开发了高效且选择性的USP1抑制剂I-138，其催化裂隙的结合亲和力达到纳摩尔级别（Liang等人，2014年；Li等人，2025年），为联合治疗提供了新的机会。针对USP1为自噬激活的胰腺癌提供了有效的化疗治疗策略（Li等人，2025年），但其在CRC中的潜力尚未得到充分探索。我们的研究通过全基因组CRISPR筛选确定了USP1作为伊立替康耐药性的关键介质，揭示了一种超越传统DNA修复途径的CREB介导的新机制，并为多种CRC模型中的USP1抑制剂联合治疗提供了转化科学依据。这些发现扩展了我们对化疗耐药机制的理解，并为临床评估USP1靶向组合疗法提供了依据。
细胞培养和试剂
结直肠癌细胞系SW620、HT-29和HCT-116购自美国典型培养物收藏中心（ATCC），并在添加了10%胎牛血清（FBS，BS-0002-500，Biosun Shandong，中国）、100μg/ml青霉素和100单位/ml链霉素的Dulbecco高葡萄糖改良Eagle培养基（DMEM）中培养。细胞在37°C、5% CO2的培养箱中孵育。使用的试剂包括伊立替康（S2217）、I-138（E1479）、SN-38（S4908）、H89（S1582）、抗pGSK-3β抗体（F0299）和GSK-3β抗体（F0142）。
通过全基因组CRISPR/Cas9系统筛选USP1对CRC细胞中伊立替康敏感性的影响
在这里，我们使用包含123,411个独特sgRNAs的人类GeCKO v2文库在HCT-116细胞中进行了基于CRISPR/Cas9的阴性筛选，这些sgRNAs靶向19,050个已注释的基因（图1）。伊立替康处理和全基因组测序后，共筛选出1330个阴性基因和656个阳性基因。我们使用MAGECK软件根据稳健排名聚合（RRA）算法对样本间差异表达的基因进行了排序，其中RRA值越低...
讨论
结直肠癌（CRC）仍然是一个重大的全球健康问题，治疗效果常常受到肿瘤异质性和获得性药物耐药性的限制（Eng等人，2024年）。尽管在治疗策略方面取得了进展，包括手术、化疗和靶向治疗，但晚期患者的生存率仍然不理想（Vogel等人，2017年；Eng等人，2024年）。伊立替康是一种广泛用于CRC治疗的拓扑异构酶I抑制剂，但由于...
CRediT作者贡献声明
蔡佩佩：方法学。宋文波：方法学。徐洪业：数据管理。程晨：软件应用。赵荣荣：监督。王涛：数据分析。王航：监督。王磊：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、软件应用、资源管理、项目协调、方法学研究、资金申请、数据管理、概念构思。鲍丽静：数据管理。徐明：撰写——审阅与编辑、数据管理、概念构思。苗敏：软件应用。刘峰：监督。
知情同意声明
不适用。
数据可用性声明
本研究中的所有数据均可在合理要求下从相应作者处获取。
数据可用性声明
本研究中的所有数据均可在合理要求下从相应作者处获取。
资助
本研究得到了扬州市科学技术局的资助（资助编号：YZ2024112）。
