人类G93A突变型SOD1与野生型SOD1纤维的结构比较

《Journal of Molecular Biology》：Structural comparison of the human G93A mutant SOD1 to the wild-type SOD1 filaments

本研究通过冷冻电镜技术分析了G93A突变型SOD1蛋白的纤维结构，发现其与野生型SOD1形成相似的单原纤维结构。突变型在天然状态下对蛋白酶解更敏感，质谱分析表明结构混乱的电荷环是两者纤维形成的共同中间结构。这些结果揭示了突变型与野生型SOD1蛋白通过相似纤维形成途径参与ALS发病机制。

　　

白英珍|李孝贞|朴恩秀|朴珉浩|魏宇琳|金贤敏|罗成勋|河南哲

韩国首尔国立大学农业生命科学学院农业生物技术系及农业生命科学研究所，首尔08826

摘要

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种进行性且致命的神经退行性疾病，其特征是铜（Cu）和锌（Zn）超氧化物歧化酶（SOD1）的错误折叠和聚集，尤其是在家族性病例中。与家族性ALS密切相关的SOD1基因G93A突变在疾病的转基因小鼠模型中得到了广泛研究。在本研究中，我们使用冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy）分析了G93A突变体SOD1的纤维结构。所得到的纤维由一个具有左旋螺旋结构的单个原纤维组成，这与在相同条件下野生型（WT）SOD1形成的纤维非常相似。自组装和交叉播种实验表明，与无种子条件相比，WT和G93A突变体SOD1均促进了纤维的形成。值得注意的是，G93A突变体在其天然状态下比WT SOD1更容易发生蛋白水解。质谱分析表明，结构无序的静电环是WT和G93A突变体SOD1纤维形成的关键中间结构。这些发现表明，WT和G93A突变体SOD1的纤维形成途径是共同的，为ALS的发病机制提供了新的见解。

引言

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种进行性且致命的神经退行性疾病，会导致上运动神经元和下运动神经元的退化[1]、[2]。这些疾病的一个关键特征是淀粉样纤维的积累，这些纤维在其发病过程中起着关键作用。SOD1基因是第一个通过与该基因中的点突变相关联而被发现与家族性ALS有关的基因，这些突变占所有ALS病例的10%[3]。在家族性和散发性ALS患者的脊髓组织中都检测到了错误折叠的SOD1聚集物[4]。值得注意的是，SOD1基因中的G93A突变与家族性ALS密切相关，并且经常用于转基因小鼠中ALS模型的开发[5]、[6]。

在生物活性形式下，人类SOD1作为32-kDa的金属酶二聚体发挥作用，促进超氧化物自由基转化为过氧化氢[7]。SOD1每个亚基包含153个氨基酸，活性位点处有一个铜离子和一个锌离子。SOD1的晶体结构由八个β链和两个α螺旋组成的反平行β桶构成，其结构稳定性由连接Cys57和Cys146的二硫键提供[8]、[9]、[10]。这个二硫键的断裂对于SOD1的纤维化转变是必不可少的[11]、[12]。我们之前的研究表明，在体外条件下，二硫键的过度氧化促进了野生型SOD1蛋白的纤维化，这表明错误折叠向野生型SOD1的传播可能有助于散发性ALS病例中病理物质的积累[13]、[14]。

SOD1的静电环（Loop VII，残基121–144）将超氧化物引导至催化铜中心，并通过与Zn²⁺和Cu²⁺离子的相互作用帮助稳定金属结合位点[15]、[16]。金属配位的丧失或致病性突变会破坏其结构，从而促进错误折叠和聚集[17]、[18]。这个环的完整性对于酶活性和抵抗纤维化至关重要[19]。

最近，液-液相分离（LLPS）的概念逐渐兴起。LLPS是一种关键的生物物理机制，通过这种机制，通常具有灵活或内在无序区域的蛋白质会自发分离形成高度浓缩的、无膜的液滴或液状细胞器[20]、[21]。与此一致，Gu等人[22]证明，SOD1蛋白的氧化和基因突变改变了细胞内和体外液滴的形态和物质状态，最终促进了SOD1蛋白从天然状态向纤维化的转变。

SOD1纤维的冷冻电子显微镜（EM）结构已经确定[23]、[24]。观察到了单个原纤维和成对纤维结构。单个原纤维由线性排列的蛋白质组成，而成对纤维则由两个相互缠绕或平行排列的原纤维组成，形成更复杂且对称的结构。野生型SOD1以及H46R和G85R突变体SOD1都显示为单个原纤维构象[23]、[24]。在我们之前的研究中，野生型SOD1的纤维显示为单个原纤维，而C6A/C111A突变体SOD1蛋白则显示为具有伪21对称性的成对纤维构象[25]。

SOD1的活性和活性位点的结构稳定性依赖于Cu²⁺和Zn²⁺离子[8]。为了促进SOD1的纤维化，通常需要使用螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）从活性位点去除金属离子。在之前对野生型SOD1纤维的冷冻EM分析中，使用了去金属化的SOD1 apo形式，在5 mM TCEP创造的还原条件下促进了纤维的形成[23]。即使在没有EDTA的情况下，去金属化的SOD1 apo形式也容易形成纤维。

在这项研究中，我们确定了由G93A突变体SOD1形成的纤维的冷冻EM结构，并将其与在相同条件下的野生型纤维结构进行了比较。随后进行了播种实验和有限的蛋白水解实验，以研究基因突变如何影响纤维化。这项研究增进了我们对神经退行性疾病发病机制中驱动纤维形成途径的理解，并提出了抑制有毒纤维生长的潜在策略。

部分摘要

G93A突变体SOD1的纤维形成更快，但天然结构下的酶活性相似

由于G93A突变体SOD1是与家族性ALS相关的基因变异体[26]，我们将其纤维形成速率与野生型SOD1进行了比较。硫黄素T测定显示，G93A突变体SOD1形成淀粉样纤维的速度明显快于野生型SOD1（图1A），这与先前的报告一致[27]、[28]。接下来，我们测量了G93A突变体SOD1与野生型SOD1蛋白的酶活性。G93A突变体的SOD1活性几乎与野生型相同

讨论

与ALS相关的已知基因突变是SOD1基因中的G93A突变，相应的突变基因在ALS小鼠模型中被广泛使用[6]、[38]、[39]。野生型和G93A突变体SOD1在其天然状态下的晶体结构非常相似[14]、[37]。此外，本研究还表明，它们在类似淀粉样的纤维状态下也显示出非常相似的结构。本研究表明，G93A突变体蛋白在其天然状态下结构上较为

质粒构建和表达

表达人类SOD1的质粒pF151 pcDNA3.1(+)SOD1 WT来自Addgene（质粒编号#26397；链接；RRID：Addgene_26397），由Elizabeth Fisher提供。使用表S1中列出的引物，通过PCR扩增SOD1基因并将其克隆到细菌表达载体pProEx-HTa（Invitrogen，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）中。所得到的pProEx-HTa::SOD1构建体包含一个N端六组氨酸标签和一个烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶切割位点，以便于纯化和标签去除。

资助和附加信息

本研究得到了韩国食品、农业、林业和渔业技术规划与评估研究所（IPET）的支持，该研究所由农业、食品和农村事务部（MAFRA）资助（项目编号RS-2021-IP321036和RS-2024-00402136，资助人为N.C.H.）。这项工作还得到了国家研究基金会（NRF）的生物与医学技术开发计划的支持，该计划由科学技术信息部（MSIT）资助（项目编号RS-2024-00344154，资助人为N.C.H.）。

作者贡献声明

白英珍：写作——审稿与编辑、撰写初稿、可视化、验证、研究、正式分析、数据管理、概念化。李孝贞：写作——审稿与编辑、撰写初稿、可视化、验证、研究、正式分析、数据管理、概念化。朴恩秀：写作——审稿与编辑、可视化、验证、研究。朴珉浩：写作——审稿与编辑、可视化、验证、研究。魏宇琳：

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：河南哲报告称获得了韩国食品、农业、林业和渔业技术规划与评估研究所的财务支持。河南哲还报告称获得了韩国科学技术信息部（KISTI）的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人

致谢

冷冻EM数据是在大分子和细胞成像中心（CMCI）收集和处理的。我们感谢Hansol Lee博士（CMCI）在冷冻EM成像方面的支持。我们还要感谢韩国科学技术信息院（KISTI）的全球科学实验数据中心（GSDC）提供的计算资源和技术支持。

关于手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明。

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