《Microbiological Research》：The Contribution of Root Border Cells as a Defense Barrier Against Soil-Borne Pathogen
Verticillium dahliae: Insights from the Host Cotton and the non-Host Corn
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根边缘细胞通过分泌富含果胶和胞外DNA的粘液层物理阻挡大丽轮枝菌入侵，并分泌黄酮类等代谢物协同抑制病原菌，为棉花抗枯萎病育种提供新机制。
张森|王晓宇|张丹|华瑞琪|闫一金|杨娟|马金虎|王杰|杨晓环
中国山西省农业大学农学院山西侯记实验室，太谷030801
摘要
立枯病可由土壤传播的真菌病原体Verticillium dahliae（V. dahliae）引起。这是一种破坏性的维管病原体，可感染200多种植物，包括棉花等经济作物。该病害会导致严重的症状，如萎蔫、黄化和坏死，最终导致产量大幅下降。传统的管理策略，包括化学杀菌剂和轮作，对V. dahliae的效果有限，这凸显了迫切需要阐明植物的内在抗性机制以培育抗立枯病的品种。在本研究中，我们探讨了根缘细胞（RBCs）对V. dahliae的防御机制。荧光显微镜和冷冻扫描电子显微镜观察表明，RBCs是存活的独立细胞，具有圆形、中间型和长型等多种形态。体外共培养实验显示，从棉花或玉米中分离出的存活RBCs显著抑制了V. dahliae的生长，而热失活的RBCs则失去了这种抗真菌能力，证实了防御机制依赖于细胞活性。进一步分析表明，在V. dahliae胁迫下，RBCs分泌一层富含果胶和胞外DNA（exDNA）的粘液层，该层包裹住真菌菌丝并形成物理屏障。通过对棉花和玉米RBC分泌物的代谢组学分析，鉴定出一组保守的代谢物，包括参与黄酮和黄酮醇生物合成、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢以及苯丙素生物合成的化合物，这些代谢物可能有助于化学防御病原体。这些发现揭示了RBCs介导的V. dahliae感染的细胞和分子机制，并为棉花抗立枯病育种策略提供了见解。
引言
能够直接与土壤相互作用的植物根系不断面临病原真菌、细菌和线虫等生物胁迫（Rudrappa等，2008；Berendsen等，2012；Yuan等，2018）。其中，Verticillium dahliae（V. dahliae）作为一种土壤传播的真菌病原体，可感染200多种植物，并引起立枯病（Klosterman等，2011）。这种维管病害会导致萎蔫、黄化和坏死（Castillo等，2021），从而在棉花、番茄和马铃薯等经济作物中造成严重产量损失（Olivain等，1997；Pegg等，2002；Fradin等，2006；Klosterman等，2011）。该病原体具有复杂的生命周期，其微菌核在土壤中可存活超过十年，会在响应宿主根系分泌物时萌发并建立感染（Inderbitzin等，2014；Zhang等，2022b）。其致病性主要归因于微菌核在土壤中的长期存活能力以及它们通过表皮或伤口直接侵入根系的能力，随后在木质部导管中定殖（Fradin等，2006）。一旦感染发生，病原体会在木质部导管中繁殖，破坏导管功能，干扰水分和养分的运输。因此，这种功能障碍会导致特征性症状，如单侧萎蔫、叶脉间黄化和叶片坏死，从而降低光合能力和产量潜力（Klosterman等，2011）。鉴于这些限制，传统的控制策略存在显著局限性。化学杀菌剂受到抗性发展和环境问题的制约，而轮作由于V. dahliae的广泛宿主范围和微菌核在土壤中的长期存在而无效（Métraux等，2009；Hawes等，2016）。因此，阐明并应用植物的内在抗性机制至关重要。
在过去的二三十年里，根际边缘细胞（RBCs）及其周围的粘液层作为抵御土壤传播病原体的主要防御屏障的作用越来越受到重视（Hawes等，2000；Gunawardena等，2002；Hawes等，2005；Vicré等，2005）。RBCs是一种独特且高度特化的细胞群，以前被称为“根冠细胞”或“脱落的根冠细胞”，起源于根冠分生组织（Vicré等，2005）。它们经历一个明确的发育过程，在根系穿过土壤时从根冠边缘主动脱落（Driouich等，2007；Kumar等，2020）。与被动磨损的细胞不同，RBCs在分离后几天内仍保持代谢活性，从而在根际发挥独特的防御功能（Driouich等，2021）。脱落后的RBCs在根尖周围形成一层活跃的保护层。这些细胞通过由根冠和RBCs分泌的含水粘液基质相互连接，该基质主要由多糖、蛋白质和胞外DNA组成（Hawes等，2000；Driouich等，2013；Wen等，2017；Ropitaux等，2020；Yang等，2025）。这种防御系统类似于哺乳动物免疫中的中性粒细胞外陷阱（NETs），被称为“根外陷阱”（RET）（Driouich等，2019；Darshan等，2020）。作为一种复杂的物理和生化屏障，RET可以捕获病原体，将其暴露在粘液中的浓缩抗菌化合物中，防止其与脆弱的根分生组织直接接触（Driouich等，2013；Ropitaux等，2020）。重要的是，随着新的根冠细胞成熟并脱落，RET会不断得到补充，确保根系伸长过程中的持续保护（Sumby等，2005；Buchanan等，2006；Driouich等，2013）。
作为植物先天免疫系统的重要组成部分，RBCs因其在被动物理防护和主动化学防御土壤传播真菌病原体方面的双重功能而受到越来越多的关注（Brisson等，1994；Driouich等，2013）。先前的研究表明，RBCs和根冠粘液共同构成了根际微环境中的主要防御界面，同时在植物应激反应中也起着关键作用（Walker等，2003；Bakker等，2018）。在非生物胁迫下，RBCs通过分泌粘液来减轻铝（Al）的毒性，抗性品种会产生更多的粘液并保持更高的细胞活性（Miyasaka等，2001；Bais等，2006）。硅可以增强这种防御作用，它在RBCs上形成Si-Al复合物，促进粘液合成，从而形成限制铝进入分生组织的屏障（Xiao等，2022）。RBCs还可以固定重金属，如铅，保护根分生组织（Huskey等，2018；Huskey等，2019）。关于生物胁迫，研究证实了RBCs的保护作用。例如，卵菌Aphanomyces euteiches的感染最初发生在豌豆的根伸长区，这可能绕过了根冠和RBC区域，证明了根尖对该病原体的局部保护作用（Cannesan等，2011）。同样，边缘细胞和根尖分泌物对根结线虫（Meloidogyne spp）具有化学吸引作用，诱导其发育停滞，有效保护根伸长组织（Zhao等，2000）。尽管这些研究展示了RBCs在应对生物和非生物胁迫中的关键作用，但它们主要关注的是未分离的细胞群体。因此，研究分离后的RBCs是否仍具有对外部胁迫的防御能力至关重要。
本研究首先验证了RBCs的存活能力，然后与V. dahliae进行了共培养实验，发现它们能够抑制菌丝生长。此外，还对RBC分泌物进行了代谢组学分析，以确定宿主（棉花）和非宿主（玉米）物种之间共有的代谢物，这些代谢物可能有助于抑制V. dahliae。总体而言，我们的发现表明RBCs在土壤中作为第一道防线，对抑制V. dahliae的入侵起着关键作用。这些结果阐明了RBC介导的病原体抗性的分子和细胞机制，并为控制棉花立枯病提供了新的策略。
部分摘要
植物材料
本研究中使用的棉花品种TM-1由山西农业大学棉花研究所提供，玉米品种 Zhengdan 958 由山西农业大学提供。
根缘细胞（RBCs）的制备方法
采用了Liu等人（2019a）描述的方法，并进行了少量修改。棉花种子用10%次氯酸钠表面消毒10分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗五次，丢弃漂浮的种子。剩余的种子浸泡在...
根缘细胞是围绕根冠的活细胞
基于现有研究，我们将棉花这种易受土壤传播病原体（如V. dahliae）影响的作物中的RBCs进行了表征，并确定了其特定结构和功能。显微镜和冷冻扫描电子显微镜（cryo-SEM）观察显示，3天大的棉花幼苗的根尖被一层明显的RBCs包围（图1A–D）。荧光染色进一步突出了边缘细胞的位置和初始...
讨论
RBCs，以前被称为边缘细胞或脱落的根冠细胞，构成了植物根系与周围土壤环境之间的关键界面（Darshan等，2020）。先前的研究表明，RBCs可以从根冠分生组织主动脱落，形成一层保护性粘液层，保护脆弱的分生组织免受非生物胁迫和病原体侵袭（Kumar等，2020；Jiang等，2023）。对玉米和其他植物物种的研究也揭示了...
结论
作为植物根冠的最外层，RBCs在保护根冠免受胁迫方面起着至关重要的作用。我们的研究表明，宿主和非宿主作物都通过RBCs介导的依赖于细胞活性的防御机制显著抑制了V. dahliae的感染，而热失活的RBCs完全失去了这种抑制功能。这种跨物种的防御共性源于双重屏障机制。在病原体挑战下，RBCs通过分泌粘液进行物理防御...
未引用的参考文献
(Andreou和Feussner，2009；Castillo-Argaez等，2021；Fradin和Thomma，2006；Fradin等，2009；Gunawardena和Hawes，2002；Inderbitzin和Subbarao，2014；Jones和Dangl，2006；Jaroszuk-Scise?等，2009；Kumar和Iyer-Pascuzzi，2020；Li等，2023；Miyasaka和Hawes，2001；Maeda和Dudareva，2012；Noctor等，2012；Olivain和Alabouvette，1997；Pegg和Brady，2002；Ramamoorthy等，2002；Xiao和Liang，2022)
资助
本工作得到了国家自然科学基金（32300582）、山西农业大学优秀青年人才培养计划（2024YQPYGC01）以及山西侯记实验室自主研究项目（202404010930003-J04）的支持。
CRediT作者贡献声明
闫一金：撰写——初稿，实验研究。杨娟：撰写——初稿。马金虎：监督，资源提供。王杰：撰写——审稿与编辑，监督，项目管理，方法学，资金获取。王晓宇：撰写——初稿，方法学，正式分析，数据管理。张丹：撰写——审稿与编辑，监督，方法学。杨晓环：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，可视化，实验研究，数据管理。
致谢
我们感谢X. Li（山西高等研究院）在样品制备和拍摄SEM图像方面的帮助。同时感谢Biotree Biotechnology Co., Ltd.（中国上海）提供的代谢组学分析服务。
