《Biomaterials Advances》：Micelle-integrated hydrogel combined with pH-response boosts eye burns therapy by inhibiting neovascularization, regulating inflammation and bacteriostasis
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pH响应智能水凝胶LEV@DG-HPMC通过物理交联和pH触发释放机制，协同左氧氟沙星抗菌与DG抗炎作用，抑制角膜新生血管化并促进角膜修复，显著提高药物在眼表滞留时间和疗效。
李雅虹|王新媛|吴美娜|任洁英|王亚楠|文超超|沈霞|田青军|王一杰|郭玉萌|薛健|段雅健|龚涛|于宝峰
山西医科大学生物化学与分子生物学系，太原，030001，中国
摘要
角膜新生血管形成（CNV）是一种威胁视力的病理过程，其挑战在于控制炎症、预防感染以及抑制血管生成。为了解决这些问题，我们开发了一种新型的pH响应型智能胶束集成水凝胶，称为LEV@DG-HPMC。该系统由二钾甘草酸（DG）和羟丙基甲基纤维素（HPMC）形成的三维网络构成，用于释放左氧氟沙星（LEV）。水凝胶网络通过物理交联形成。在这个系统中，LEV具有强大的抗菌活性，而DG则具有天然的抗炎特性。LEV@DG-HPMC水凝胶表现出优异的生物相容性，并显著延长了在眼表的滞留时间。其独特的pH响应型药物释放特性与碱损伤后病理微环境中的pH变化紧密匹配。重要的是，该水凝胶展现了协同治疗效果，结合了强大的抗菌活性以及显著下调关键炎症细胞因子和抑制促血管生成因子（如白细胞介素-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α、核因子-κB、血管内皮生长因子A、基质金属蛋白酶-9）的能力。因此，它有效抑制了CNV的进展，减少了角膜混浊，并促进了角膜修复。这种多功能智能水凝胶为CNV的治疗提供了一种非常有前景的策略。
引言
角膜新生血管形成（CNV）是全球主要的视力障碍原因之一，每年影响4.1–10.4%的人口，并导致12–57.4%的患者失明。这种情况主要作为各种角膜损伤和疾病的并发症出现，包括感染性角膜炎、化学烧伤、机械性创伤以及角膜移植后的免疫排斥[1]。其发病机制是一个复杂的过程，受多种因素调控，特别是由炎症级联反应的激活、促血管生成因子的过度表达以及组织修复微环境的失调所触发[1]。目前用于预防和治疗化学烧伤后CNV的临床策略仍然非常有限[2]。传统治疗方法主要依赖于糖皮质激素和抗菌剂的联合使用。前者通过抑制炎症反应间接影响血管生成，而后者旨在控制继发感染。然而，糖皮质激素眼药水的在眼表滞留时间短且生物利用度低。长期使用还可能增加眼内压、诱发白内障、延迟上皮修复，甚至加剧角膜溶解。另一方面，尽管抗血管内皮生长因子（VEGF）药物在抑制血管生成方面表现出一定的效果，但其单一的作用机制不足以应对CNV的多途径调控[3]。此外，重复注射的需求增加了治疗负担和并发症的风险[3]。因此，迫切需要开发新型配方，将抗炎和抗菌功能结合起来，以实现新生血管的抑制，同时提供优异的眼表滞留性和安全性，以治疗眼烧伤后的CNV[4]。
细菌是眼烧伤后最常见且最危险的感染性病原体[5]。左氧氟沙星（LEV）是一种广谱氟喹诺酮类抗生素，对革兰氏阴性和某些革兰氏阳性细菌有效，因此在眼烧伤后的早期抗感染治疗中得到广泛应用[6],[7],[8]。然而，传统的LEV眼药水在临床应用中存在显著局限性，包括在眼表滞留时间短、难以穿透角膜生理屏障和细菌生物膜，以及长期或频繁使用可能引起的角膜毒性，这些都会影响治疗效果[3]。纳米材料为克服这些挑战提供了有希望的策略。将药物封装在纳米载体中可以显著提高药物的渗透性和滞留时间，实现主动靶向或被动积累，减少给药频率，并便于在眼烧伤早期进行局部给药。由于这些优势，纳米材料被认为是解决眼烧伤抗感染治疗当前局限性的可行方法[9]。
基于纳米粒子的水凝胶是一种有前景的眼科药物递送平台，能够精确控制药物释放，从而提高治疗效果。研究表明，各种类型的水凝胶，如二钾甘草酸（DG）胶束水凝胶[10]、聚乙二醇（PEG）聚合物[11]、聚（乳酸-羟基乙酸）（PLGA）-PEG-PLGA共聚物[12]和聚氧酰胺[13]，可以装载蛋白质或小分子药物。这些系统表现出多种药理活性，如抗氧化和抗炎作用，显示出抑制CNV的显著潜力[14],[15]。此外，它们能够响应环境信号（如pH值、温度和活性氧物种），实现与病理进程同步的智能药物释放[16]。这些出色的特性使水凝胶成为针对化学烧伤的下一代智能药物递送系统的理想候选者[11]。
本研究专注于pH响应型水凝胶在药物递送中的应用。先前的研究表明，将载药pH响应型微腔嵌入隐形眼镜中可以在正常眼表pH条件下有效抑制药物扩散，而在pH值低于6时加速释放[17]。Rehman等人[18]合成了基于壳聚糖/葫芦巴-g-聚（甲基丙烯酸）的智能pH响应型水凝胶，在碱性条件下表现出更明显的释放效果。Yu等人[19]开发了一种双响应型水凝胶，由羧甲基壳聚糖和聚氧酰胺407组成，在pH 2.5和7.4下的释放行为有显著差异，这与水凝胶的膨胀程度相关。Gao等人[20]构建了用于装载托布霉素的新型pH响应型纳米颗粒。该系统通过pH响应型化学键实现智能药物释放，并表现出明显的pH依赖性抗菌活性，为铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）引起的角膜溃疡提供了新的精确治疗策略。这些研究共同支持了利用病理pH信号进行精确药物控制的通用策略。然而，在开发基于水凝胶的系统时仍存在一些挑战。首先，机械强度不足可能导致药物滞留时间缩短，从而降低治疗效果。此外，还存在潜在的生物安全性问题，主要源于材料本身的生物相容性限制及其降解产物可能引起的局部炎症或免疫反应[1],[10]。
为了解决这些限制，我们开发了一种新型的智能pH响应型多功能水凝胶系统。该系统使用具有良好生物相容性的自组装DG纳米胶束作为LEV的载体。首先构建了LEV-DG纳米胶束，然后通过分子间力（包括氢键和疏水相互作用）自组装成LEV@DG水凝胶系统，以实现更持久和更安全的眼部药物递送。为了延长药物在眼表的滞留时间，加入了羟丙基甲基纤维素（HPMC）以增强水凝胶的机械强度和生物粘附性。LEV@DG-HPMC水凝胶系统还表现出强大的安全性。LEV和HPMC都是获得食品药品监督管理局批准的药物成分，DG是一种广泛用于药物和化妆品的安全成分。此外，水凝胶网络仅通过物理相互作用形成，有效避免了化学交联相关的生物相容性问题。值得注意的是，该系统的优势不仅体现在结构设计上，还体现在功能协同上，实现了全面的治疗策略。载体DG与LEV协同作用，提供抗炎和抗菌效果，而其两亲分子的pH响应性使其能够精确感知碱性条件，实现智能药物释放（图1）[21],[22]。为了验证这一策略，研究依次进行了以下工作：首先，在体外表征了水凝胶的物理化学性质、在不同pH条件下的药物释放行为及其流变特性，验证了其pH响应型智能药物释放能力。其次，抗菌实验确认了其协同抗菌效果。最后，使用细胞和动物模型系统评估了其生物相容性、组织安全性以及减轻炎症、抑制新生血管形成和促进角膜修复的效果。本研究为解决传统眼药水的单一功能和低生物利用度问题提供了新策略，并为水凝胶在眼表重建中的进一步应用奠定了实验基础。
材料
DG（分子量，Mw = 899.12）购自Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.（上海，中国）。LEV（Mw = 361.37）和HPMC（纯度>98%）购自Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.（上海，中国）。Fast Tissue RNA Purification Kit (EZB-RN5) 从EZBioscience Co., Ltd.（苏州，中国）购买。M5 Super plus qPCR RT Kit with gDNA remover和2 × M5 HiPer Realtime PCR Super mix with Low Row (SYBRgreen, with anti-Taq) 从Mei5购买
LEV-DG胶束的特性
Zeta电位是评估胶束稳定性的关键参数。较高的绝对值表示更高的胶束稳定性[30]。在不同的质量比（LEV: DG = 1:1至1:10）下评估了LEV-DG胶束的粒径、多分散指数（PDI）和zeta电位。最佳配方是在质量比为1:6时获得的，其特征是平均粒径最小（64.77 ± 0.72）nm，PDI为0.24 ± 0.02，zeta电位为（?31.62 ± 1.12）mV
讨论
CNV是与角膜碱烧伤相关的致盲主要原因[13]。急性期（受伤后第一周）的核心目标是控制炎症和预防并发症。目前的临床方法通常使用局部皮质类固醇眼药水来强烈抑制炎症，从而减少角膜溶解和抑制CNV的形成。然而，类固醇也可能延迟角膜修复，并增加组织溶解甚至穿孔的风险
结论
本研究开发了一种物理交联且pH响应型的LEV@DG-HPMC水凝胶。该系统利用DG构建智能LEV-DG胶束，这些胶束通过羧基团的离子化经历可逆的分散-聚集转变，从而将药物释放从扩散驱动模式转变为环境触发调节模式。结合生物粘附性基质HPMC，该设计解决了药物在眼表滞留时间短和释放控制不精确的问题
数据可用性
支持本研究发现的数据可应要求向相应作者索取。
CRediT作者贡献声明
李雅虹：写作 – 审稿与编辑，写作 – 原始草稿，可视化，验证，监督，项目管理，方法学，研究，正式分析，数据管理，概念化。王新媛：可视化，验证，研究，正式分析，数据管理。吴美娜：可视化，验证，研究，正式分析，数据管理。任洁英：可视化，验证，研究，正式分析，数据管理。王亚楠：项目资助
本研究的资金由中国中央地方科技发展引导基金（授权号：YDZJSX2024D063）、山西淋巴瘤精准诊断与治疗重点实验室（授权号：KFKT2024001）、山西白求恩医院基金会（授权号：2021RC005）、山西眼科重点实验室开放项目（授权号：2023SXKLOS01）和山西医学会研究项目（授权号：YSXH-QL2024YK002）提供。
