《Cancer Immunology, Immunotherapy》：Single-cell sequencing and network pharmacology coupled with molecular docking and experimental validation reveal the effects of YPFS on macrophages in stage I non-small cell lung cancer
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本研究针对非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤微环境中巨噬细胞异质性调控机制不明的难题，通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)构建早期NSCLC免疫图谱，结合网络药理学和分子对接技术，发现玉屏风散(YPFS)活性成分槲皮素可通过靶向AHSA1有效抑制M2型巨噬细胞极化，为中医药现代化抗肿瘤研究提供了新靶点和新策略。
肺癌作为全球癌症相关死亡的主要原因之一，其中非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的亚型。早期NSCLC（Ⅰ期）为研究肿瘤发生发展的细胞和分子机制提供了独特窗口。肿瘤微环境(TME)的高度复杂性和细胞异质性，特别是巨噬细胞亚群的表型多样性和功能作用，是当前肺癌治疗面临的主要临床挑战。巨噬细胞作为免疫微环境的核心组分，呈现从经典激活的M1表型（介导抗肿瘤反应）到替代激活的M2表型（通常与肿瘤进展和免疫抑制相关）的活化状态谱系。巨噬细胞极化和功能的复杂动态在塑造肿瘤免疫景观和影响临床结局中起着关键作用。
与此同时，利用中药作为癌症治疗补充策略的兴趣日益增长。玉屏风散(YPFS)作为广泛认可的中药方剂，传统上用于增强机体免疫反应。尽管有其历史应用和报道的免疫调节作用，YPFS影响肿瘤微环境（特别是其对巨噬细胞的影响）的分子机制仍 largely 未探索。
为了深入解析早期NSCLC免疫微环境特征并探索YPFS的潜在抗肿瘤机制，研究人员在《Cancer Immunology, Immunotherapy》上发表了最新研究成果。该研究通过整合单细胞转录组学与网络药理学，系统揭示了YPFS活性成分调控巨噬细胞极化的新机制。
研究采用的关键技术方法主要包括：从GEO数据库获取GSE117570和GSE198099数据集的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据，使用Seurat软件包进行质控和细胞分群；通过CellChat包分析细胞间通讯网络；从TCMSP数据库筛选YPFS活性成分并进行网络药理学分析；运用AutoDock Vina进行分子对接模拟；利用GEPIA数据库进行生存预后分析；通过免疫荧光染色和流式细胞术实验验证AHSA1表达及巨噬细胞极化状态。
研究结果
综合单细胞图谱揭示Ⅰ期NSCLC特征
研究人员分析了两个单细胞肺癌数据集，仅选择Ⅰ期NSCLC样本来构建分析数据集。总共37,142个细胞被分为八大主要细胞类型：T/NK细胞(18,238个)、巨噬细胞(8,983个)、上皮细胞(6,517个)、B细胞(1,581个)、浆细胞(692个)、内皮细胞(601个)、成纤维细胞(308个)和肥大细胞(222个)。比较细胞比例分析显示，肿瘤中浆细胞、B细胞和上皮细胞水平升高，而巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞在肿瘤样本中减少。
巨噬细胞单细胞全景图
8,983个巨噬细胞被分为18个簇，进一步鉴定出四种主要功能性巨噬细胞亚型(MAC1-MAC4)。亚型比例分析表明MAC1在肿瘤中富集，MAC2和MAC4减少，MAC3在肿瘤和正常肺组织之间比例相当。基因集变异分析(GSVA)显示巨噬细胞亚型在生物学过程和基因表达模式上存在差异。
YPFS网络药理学分析与靶点筛选
通过网络药理学分析获得YPFS的37种活性化合物和188个对应靶基因。与单细胞数据中巨噬细胞相关基因和NSCLC预后相关基因取交集后，鉴定出AHSA1为关键靶点。生存分析显示AHSA1高表达与较差预后相关。单细胞表达分析表明AHSA1在上皮细胞中表达最高，在巨噬细胞中也有显著表达，尤其在MAC3亚型中表达峰值。组织芯片免疫荧光染色证实肿瘤组织中巨噬细胞的AHSA1表达升高。
分子对接模拟
分子对接模拟显示槲皮素与AHSA1的结合能最低(-6.5 kcal/mol)，解离常数最小(16.98 μM)，主要通过范德华力、氢键和Pi-Pi相互作用结合，表明结合最紧密稳定。木犀草素和汉黄芩素也表现出良好结合活性。
YPFS成分抑制巨噬细胞M2极化
通过单细胞评分发现AHSA1阳性巨噬细胞具有显著较低的M1评分和较高的M2评分。流式细胞术实验证实木犀草素、汉黄芩素和槲皮素均能抑制IL4诱导的THP1细胞M2极化，其中槲皮素抑制作用最显著，与分子对接结果一致。
AHSA1阳性/阴性巨噬细胞通讯网络
细胞通讯分析显示，AHSA1阳性巨噬细胞通过CD99-CD99和ADGRE5-CD55受体-配体对影响T/NK细胞，而AHSA1阴性巨噬细胞无类似相互作用。肿瘤微环境中细胞通讯整体强度较正常肺组织显著降低，仅8条通路显著激活，而正常组织有23条通路特异性激活。
讨论与结论
该研究通过构建Ⅰ期NSCLC综合单细胞图谱，深入表征了肿瘤微环境中的细胞组成和细胞间相互作用，特别关注巨噬细胞亚群、其极化状态及其受YPFS的潜在调控。研究发现巨噬细胞在肿瘤和正常肺组织群体之间存在显著异质性，MAC1巨噬细胞（主要与生物合成相关功能相关）在肿瘤组织中富集，表明肿瘤可能积极重塑免疫微环境以支持其生长和免疫逃逸。
AHSA1作为药理网络分析中的关键交叉基因，在调节巨噬细胞极化和促进癌症进展中具有潜在作用。研究证实AHSA1在NSCLC预后不良患者中表达升高，且YPFS衍生成分（特别是槲皮素）可通过靶向AHSA1有效抑制M2巨噬细胞极化。细胞通讯网络分析发现的差异性受体-配体相互作用（特别是ADGRE5-CD55对）为AHSA1阳性巨噬细胞促进肿瘤增殖和调节免疫反应提供了机制线索。
该研究也存在一定局限性：分子对接结果需要体外和体内实验进一步验证；研究仅限于Ⅰ期NSCLC，可能无法完全反映疾病进展的异质性；M1-M2二元分类不能完全反映巨噬细胞的表型复杂性和可塑性。
综上所述，这项研究为NSCLC肿瘤微环境的细胞动力学提供了重要见解，突出了AHSA1和YPFS衍生成分作为治疗干预的有希望候选物。通过整合单细胞转录组学与网络药理学，研究揭示了肿瘤-免疫相互作用的关键机制，并确定了调节巨噬细胞功能和增强免疫介导的肿瘤抑制的潜在策略。这些发现为未来转化研究奠定了基础，旨在改善肺癌患者的临床结局。
