一种基于上转换纳米颗粒和氧化石墨烯的发光共振能量转移平台，用于细胞色素C的检测

《Microchemical Journal》：A luminescence resonance energy transfer platform based on upconversion nanoparticles and graphene oxide for cytochrome C detection

本研究开发了一种基于稀土掺杂上转换纳米颗粒（UCNPs）和石墨烯氧化物（GO）的LRET生物传感平台，用于选择性检测细胞色素c。该平台通过aptamer与GO的π-π堆积作用实现发光淬灭，结合目标后aptamer构象改变脱离GO表面，恢复发光信号。检测限低至450 nM，选择性好，血清样品回收率高，为细胞凋亡相关生物分子研究和临床诊断提供了新方法。

　　

郑耀文|李玉瑶|董佳瑶|易静|刘柳|唐鸿武

武汉大学化学与分子科学学院，中国武汉430072

摘要

背景

细胞色素c是与线粒体凋亡相关的重要生物标志物，其灵敏检测对于研究细胞过程和评估相关生物反应非常有用。目前的分析方法通常涉及多步骤操作或标记程序，这凸显了需要一种更简单、更易获得的检测策略。

结果

我们开发了一种基于镧系掺杂上转换纳米粒子（NaYF?: Yb, Er@NaYF?）和氧化石墨烯的发光共振能量转移生物传感器，用于选择性检测细胞色素c。适配体通过π–π堆叠与氧化石墨烯结合，在980 nm激发下有效抑制了发光。当适配体与细胞色素c结合时，其构象变化减弱了这种相互作用，从而恢复了上转换发射。该传感器的检测范围为1–10 μM，检测限为450 nM，对常见干扰物具有高选择性，并在血清样本中实现了令人满意的回收率，相对标准偏差低于10%。

意义

这种无标记平台提供了一种直接可靠的方法来检测细胞色素c，无需复杂的制备或处理步骤。其设计理念也为构建具有更好可用性和分析性能的未来发光共振能量转移生物传感器提供了实际指导。

引言

细胞色素c（Cyt C）是一种存在于线粒体膜间隙中的关键血红蛋白蛋白，在呼吸链中充当电子载体，并作为内在凋亡的关键调节因子[1]，[2]。在程序性细胞死亡过程中，Cyt C从线粒体释放到细胞质中，在脱氧腺苷三磷酸（dATP）的存在下与Apaf-1结合形成凋亡小体，进而激活caspase级联反应，导致细胞凋亡[3]。值得注意的是，在接受化疗或免疫治疗的癌症患者血清中检测到了Cyt C，表明它可能在肿瘤细胞凋亡过程中释放到循环系统中[4]。因此，Cyt C被视为评估治疗反应的有希望的生物标志物。此外，Cyt C水平的改变与多种疾病的早期诊断有关，包括心肌梗死和系统性炎症反应综合征[5]。因此，建立灵敏可靠的Cyt C检测方法对于机制研究和潜在的临床诊断应用具有重要意义。迄今为止，已经采用了多种分析技术来定量Cyt C，如流式细胞术[6]、酶联免疫吸附测定[7]、电化学传感[8]、表面增强拉曼光谱[9]、纳米荧光测定[10]以及基于Cyt C氧化酶/还原酶的生物传感器[11]，[12]。其中，荧光检测具有优异的灵敏度、操作简便性和在复杂生物基质中的实时监测能力。其非破坏性特性和高信噪比使其特别适用于高精度临床诊断。

F?rster共振能量转移（FRET）已被广泛用作荧光生物传感的强大机制[13]。然而，传统FRET的性能常常受到背景自荧光干扰和短波长激发下的光漂白的限制，这可能影响复杂生物基质中的检测灵敏度和准确性[14]。发光共振能量转移（LRET）是在FRET基础上发展起来的，通过长程偶极-偶极相互作用实现从激发态供体到附近受体的非辐射能量转移[15]。通过使用抗斯托克斯发光上转换纳米粒子（UCNPs）作为长寿命能量供体，LRET有效克服了这些限制，提供了近红外（NIR）激发和极低的背景信号[16]，显著提高了信噪比。具有窄且可调发射带的核壳UCNPs——通过惰性壳层进一步稳定以抑制表面淬灭[17]——可以最佳匹配各种LRET受体，以满足精确分子检测的需求[18]，[19]。

在各种受体材料中，氧化石墨烯（GO）因其优异的光学和表面特性而受到特别关注。作为一种独特的二维碳基纳米材料，GO具有广泛的π共轭网络和丰富的含氧功能基团，这不仅赋予了其优异的水分散性，还通过π–π堆叠和氢键实现了对生物分子的强吸附[20]。在基于UCNP的LRET检测中，GO常被称为“通用淬灭剂”，因为它具有非常宽的吸收截面，确保与UCNPs的多个发射带完美重叠[21]。这种高淬灭效率使得能够开发出灵敏的“开启”平台，这些平台已成功应用于检测多种目标，如可溶性致癌基因和抗生素抗性基因[22]。总体而言，这些特性突显了UCNP-GO组合在复杂生物基质中进行可靠临床诊断的潜力。

在这项工作中，我们开发了一种基于适配体的LRET纳米传感平台，利用GO的优异淬灭特性进行选择性Cyt C检测（图1）。在980 nm激发下，具有540 nm和655 nm双上转换发射的核壳NaYF?: Yb,Er@NaYF? UCNPs被Cyt C特异性适配体功能化。在没有Cyt C的情况下，适配体通过π–π相互作用吸附在GO表面，使UCNPs靠近GO并导致有效的LRET淬灭。当目标结合时，适配体的构象变化使其从GO表面脱离，恢复上转换信号。这种基于GO的开启机制为凋亡相关生物分子研究和潜在的临床分析提供了一种简单、无标记且可靠的方法。

章节片段

核壳UCNPs的合成与表征

根据优化的条件合成NaYF?: Yb, Er@NaYF?核壳UCNPs（图S1），核壳比为1:1，加热时间为45分钟，温度为300°C。使用TEM、XRD和光谱方法对合成的UCNPs进行了表征。TEM成像显示，核NaYF?: Yb, Er UCNPs呈球形，粒径分布均匀，约为24.2 nm（图1a）。涂覆惰性壳层后，

结论

在这项工作中，我们开发了一种基于UCNPs和GO的LRET生物传感平台，用于灵敏检测细胞色素c，解决了小有机分子对UCNPs的淬灭效率低的问题。核壳UCNPs在980 nm激发下表现出强烈的上转换发射，其发射光谱与GO的宽吸收带很好地重叠，通过适配体和GO之间的π–π相互作用实现了有效的能量转移和完全淬灭。

核心UCNPs（C-UCNPs）的合成

UCNPs采用逐步高温共沉淀法合成[24]。将YCl?·6H?O（242.8 mg）、YbCl?·6H?O（69.8 mg）和ErCl?·6H?O（7.7 mg）分散在100 mL三颈烧瓶中的油酸（6 mL）和1-十八烯（15 mL）中。混合物在40°C下脱气30分钟，然后在氩气下加热至150°C加热1小时以去除配位水。冷却至室温后，逐滴加入含有NH?F（148 mg）和NaOH（100 mg）的甲醇溶液（8 mL），

CRediT作者贡献声明

郑耀文：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，方法学，数据管理。李玉瑶：正式分析，概念化。董佳瑶：数据管理，概念化。易静：数据管理，概念化。刘柳：可视化，验证。唐鸿武：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，资源获取，方法学，研究，资金筹集。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号22277096和22577098）的资助。我们感谢武汉大学的核心设施对本工作中材料结构和性质的表征。