《Vaccine》：Single-dose mSEB–mi3 nanoparticle vaccine elicits robust humoral immunity and protects mice against SEB intoxication and MRSA infection
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本研究构建表达突变SEB的mi3纳米颗粒疫苗，通过优化佐剂显著增强小鼠免疫应答，单次肌注即可有效预防SEB中毒和MRSA感染，且安全性良好。
廖子怡|吴美琳|陈园|朱子帆|李宇航|梅秋军|黄波|程鑫|张毅|曾浩|马代远|顾江
中国陆军军医大学药学院微生物与生化药学系，国家免疫制品工程研究中心，重庆400038
摘要
金黄色葡萄球菌（SA）会导致严重的医院内和社区获得性感染，但目前尚无获批的疫苗。葡萄球菌肠毒素B（SEB）是一种保守的毒力因子，是疫苗开发的关键靶点。然而，SEB蛋白亚单位疫苗的免疫原性往往有限。自组装的mi3纳米颗粒提供了一个高效的抗原展示平台，可能克服这些限制。我们通过将脱毒的突变SEB（L45R, Y89A, Y94A）展示在mi3支架上，开发了一种纳米颗粒疫苗（mSEB-mi3）。生物物理特性分析证实这些颗粒稳定且均匀，并具有高效的抗原结合能力。我们比较了不同佐剂（ALPO4、CpG ODN1018、AS01、MF59）在小鼠体内的效果，评估了它们对树突状细胞（DC）的摄取/成熟、体液反应以及对SEB中毒和耐甲氧西林SA（MRSA）ST59感染的保护作用，并进行了安全性评估。我们成功制备出了均匀且稳定的mSEB-mi3纳米颗粒。mSEB-mi3显著增强了树突状细胞的摄取和成熟，并引发了快速、高水平的持久抗体反应，IgG1/IgG2a亚型比例平衡。功能上，单次肌肉注射即可提供对SEB中毒和SA ST59挑战的强保护作用。此外，其在血液学、化学、细胞毒性和组织病理学方面的安全性表现良好。这些结果表明mSEB-mi3是一种有前景且可扩展的针对SA和SEB毒素的纳米颗粒疫苗。研究结果支持进一步探讨其持久性、菌株覆盖范围和转化开发。
引言
金黄色葡萄球菌（SA）是医院内和社区获得性感染的主要致病菌[1],[2]，可引起严重的皮肤和软组织感染、骨髓炎和菌血症，甚至导致死亡[3]。2019年，全球约有107万人死于SA感染，使其成为仅次于结核分枝杆菌的主要细菌性死亡原因[4]。耐甲氧西林SA（MRSA）的出现和全球传播大大增加了临床管理的复杂性和负担，尤其是在免疫功能低下的人群中[5]。传统抗生素治疗效果有限，这凸显了需要创新策略来应对SA感染。疫苗接种是一种特别有前景的方法：它可以从源头预防感染，减轻疾病严重程度，降低死亡率，并减少抗生素的使用，从而有助于控制SA感染和抗菌素耐药性[6]。
葡萄球菌肠毒素B（SEB）是SA的主要毒力因子，可驱动疾病进展和免疫逃逸[7]。作为一种超抗原，SEB能结合MHC II类分子，并直接与共刺激受体CD28和CD86结合[8],[9]，引发广泛的T细胞激活和细胞因子风暴，最终导致严重的毒性休克综合征并加速死亡[10],[11]。SEB在主要的社区相关SA菌株（如ST59菌株）中广泛存在[12]。其结构高度保守且稳定[13]，可通过气溶胶传播，并被归类为B类潜在生物威胁剂[14]。因此，SEB是开发SA疫苗的理想抗原靶点。
脱毒的SEB突变体消除了超抗原活性，在多种动物模型（包括小鼠、仔猪和恒河猴）中表现出强大的保护效果[15],[16]。编码脱毒SEB的mRNA疫苗也在小鼠中引发了强烈的免疫反应[12]。针对SEB的单克隆抗体（M0313 [7]、MB102a [17]）和纳米抗体（Nb6 [18]、Nb8 [19]）同样具有保护作用。我们的团队开发了一种包含L45R、Y89A、Y94A突变的五抗原SA疫苗（rFSAV），目前正在进行III期临床评估（项目编号CTR2016004[20]）。然而，与许多蛋白亚单位疫苗一样，mSEB单独使用时的免疫原性不佳，尤其是在免疫功能低下的患者中保护效果有限。
纳米颗粒可以增强抗原呈递细胞的亚单位抗原摄取和交叉呈递，从而增强免疫反应[21]。mi3纳米颗粒由2-酮-3-脱氧磷酸葡萄糖酸（KDPG）醛缩酶衍生而来，自组装成由60个同源亚单位组成的笼状支架[22]，可作为高效的递送平台[23]。利用SpyTag-SpyCatcher系统，将流感病毒神经氨酸酶（NA）、经典猪瘟病毒（CSFV）E2糖蛋白和猴痘病毒M1R/A35R抗原结合到mi3表面，显著提高了疫苗的保护效果[22],[24],[25]。为了增强mSEB的免疫原性和保护作用，我们使用SpyTag-SpyCatcher系统将其表面展示mSEB（mSEB-mi3），系统优化了该纳米颗粒平台的佐剂配比，并在小鼠毒素挑战和细菌感染模型中评估了其保护效果和作用机制。
伦理声明
所有动物实验均符合中国《实验动物管理条例》的规定。研究方案，包括动物饲养和管理程序，已获得陆军军医大学动物伦理与实验委员会批准（批准编号AMUWEC20226292）。
细菌菌株和实验动物
本研究使用了耐甲氧西林SA（MRSA）ST59菌株[11]。所有实验均使用从特定无病原体（SPF）环境中购买的6-8周龄雌性BALB/c小鼠进行
mSEB-mi3纳米颗粒的制备与表征
图1A展示了使用SpyCatcher-mi3和mSEB-SpyTag生成多价mSEB-mi3颗粒的模块化组装过程。重组的mSEB–SpyTag和mi3–SpyCatcher在大肠杆菌中表达，并以可溶形式获得。SDS–PAGE分析显示两种纯化蛋白的分子量分别为约29 kDa和约34 kDa（图1B）。优化结合条件后，确定SpyCatcher–mi3与mSEB–SpyTag的摩尔比为1:2时，共价结合的比例最高讨论
在本研究中，我们成功制备了mSEB-mi3纳米颗粒，该颗粒在自组装的mi3纳米颗粒上展示了工程化的SEB抗原。这种均匀稳定的构建体增强了抗原的呈递效果，显著提高了树突状细胞的摄取和成熟，并引发了快速、高水平的持久抗体反应，IgG1/IgG2a亚型比例平衡。功能上，单次肌肉注射即可提供对SEB中毒和SA ST59挑战的强保护作用。
CRediT作者贡献声明
廖子怡：撰写原始稿件，数据整理。吴美琳：正式分析，数据整理。陈园：撰写原始稿件，正式分析。朱子帆：正式分析，数据整理。李宇航：正式分析，数据整理。梅秋军：正式分析，数据整理。黄波：正式分析，数据整理。程鑫：正式分析，数据整理。张毅：正式分析，数据整理。曾浩：正式分析，数据整理。马代远：监督，资源提供，实验设计。伦理批准和参与同意
所有动物护理和实验均遵守伦理规定，并获得了陆军军医大学动物伦理与实验委员会的批准（批准编号AMUWEC20226292）。
资金支持
本研究得到了中国国家重点研发计划（2024YFC2310801）和成都科技项目（2025-YF11-00033-HZ）的支持。作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
