告别酶法局限：Covaris AFA技术提升生殖系测序的稳定性与准确性（下篇）

生殖系测序通常基于全基因组测序或外显子测序分析遗传性基因变异，评估个体对特定疾病（尤其是罕见病和癌症）的易感性。而生殖系测序有别于一般研究，对于测序流程的稳定性要求更高，需要优化现有工作流程以提高精准度、工作效率，解决诸如DNA片段化不一致、文库转化率欠佳、针对样本输入量变化的繁琐优化及其导致的测序偏差等关键挑战，确保高质量数据产出和准确的变异调用。

Covaris基于非接触式自动聚焦超声（AFA®）技术推出了truCOVER WGS PCR-free Library Prep Kit (PN 520361，以下简称truCOVER)，提供了一种简单易用的解决方案，是生殖系样本制备的理想选择。本文通过实测数据证明了AFA+truCOVER试剂盒能缩短处理时间、提高文库转化率、在同一供体的不同样本类型间具有高度一致性。

Covaris AFA技术的优势 

1. 简化实验流程，节省多达30%的时间

基于Covaris AFA®技术和truCOVER试剂盒可在单管中完成DNA片段化、末端修复和接头连接等文库制备过程，实现片段大小的精准控制，结果稳定可重复，并且减少转移步骤，显著降低流程复杂性和周转时间。并通过磁珠法完成片段大小筛选，且文库纯化后只需通过质量（荧光法）即可进行定量（可根据用户偏好选择是否进行qPCR），实现了QC工作流程的简化（图1）。与其它方法相比，truCOVER文库制备工作流程可节省多达30%的时间。

图1. AFA+truCOVER文库制备工作流程与其它方法（采用其它机械法或酶切片段化方法）之间的工作流程比较。

2. 以3倍的覆盖度提升flowcell利用率

在NGS工作流程中，与酶法片段化相比，采用Covaris AFA®技术的机械剪切可显著提高目标区域富集效率，意味着目标DNA序列占比更高，能实现更均一的批次效果，降低实验失败率。

图3. 与酶切片段化相比，Covaris AFA剪切的富集倍数更高。

3. 提高文库转化率

文库制备转化是指片段化DNA转化为接头连接片段（即可测序分子）的效率。这是衡量文库制备成功与否的关键指标，特别是在处理投入量低或降解样本时。低效的酶促反应、接头二聚体形成和不理想的大小选择都可能导致测序产出低和测序偏差。因此需要使用优化的方案和高质量的试剂来确保稳健的文库制备。

下面基于Qubit和 qPCR测定使用不同片段化方法（酶法/AFA）和不同建库试剂盒的文库转化率：

• 通过Qubit或qPCR质控，均表明AFA+truCOVER文库制备工作流程显示出高度一致的文库转化率（qPCR:Qubit比率 = 0.91）（图5），也验证了样本的文库转化质控可以使用快速的Qubit来替代qPCR。

相比之下，其它文库制备方式均表现出显著偏差（图5）：

• 当使用AFA技术+其它文库制备试剂盒时，观察到更高的Qubit偏差（qPCR:Qubit为0.46-0.72）。

• 当使用酶法进行片段化+其它文库制备试剂盒时，观察到更高的qPCR偏差（qPCR:Qubit在1.43-1.57之间）。

图5. 基于Qubit（蓝色）和 qPCR（橙色）测定使用不同片段化技术与建库试剂盒的组合的文库转化率（%）。

此外，通过Qubit 测定，AFA+truCOVER文库制备流程在三种不同样本类型（血液、唾液和对照）中的文库转化率范围为38.3-40.1%。相比之下，酶法片段化+文库制备试剂盒则表现出更大的变异性（28.1-34.4%，图 6）。

图6. 通过Qubit结果比较三种不同样本类型（血液（橙色）、对照（蓝色）和唾液（绿色））的DNA文库转化率。

4. 杜绝交叉污染

Covaris的自动化、非接触式工作流程从根源上避免了交叉污染的可能，无需重复实验，也不必担心昂贵样本的替换问题。简化的数据处理与分析流程，可节省时间与计算资源。

“……机械剪切确实大幅降低了我们大规模实验的复杂性……我们现在配备了多台Covaris R230设备，用于文库制备的初始阶段，缓解了酶法剪切带来的复杂性问题。” 

——Matthew C. Gallen（公共卫生硕士） 

Quest DIAGNOSTICS 

分子基因组与肿瘤研发部 高级诊断科学总监

NGS文库构建小贴士 

1. 建议使用毛细管电泳系统（如Qiagen片段分析仪）评估文库片段大小分布。

2. 建议使用荧光法（如Qubit荧光计或PicoGreen™测定）确定文库中双链DNA的浓度。

3. 如果遇到FFPE样本，由于其DNA 常经过化学修饰，会极大地影响扩增效率，因此在Pooling之前，建议使用KAPA ® Library Quantification Kit (Roche ® PN KK4824)对从FFPE样本制备的文库进行定量，该试剂盒使用与P5和P7 Illumina 接头序列互补的引物，能够精确定量可测序（即可扩增）的分子。

4. 对高质量的样本可以选择基于质量的（基于荧光法）定量，对降解的或具有挑战性的DNA样本选择基于qPCR的（基于可扩增性的）定量，均可实现样本Pooling准确性。并且基于质量的定量方式，不仅能节省耗材，还能省时省力。

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