多重荧光成像技术助力空间生物学研究

多重成像技术能够对同一组织样本中的多个生物标志物进行观察和定量，为了解细胞如何相互作用提供重要线索。在此，我们将探讨多重荧光成像技术的演化，以及研究人员在选择平台时应考虑哪些因素。

多重荧光成像技术

从广义上讲，对蛋白质和mRNA的多重荧光成像技术分别采用荧光基团标记抗体（免疫荧光）和荧光基团标记互补寡核苷酸探针（荧光原位杂交）来检测感兴趣的靶点。

免疫荧光技术最早出现在1941年，当时Coons等人利用FITC标记的抗体来观察小鼠组织中的肺炎链球菌。此后，抗体标记技术的进步让研究人员能够同时检测2-4种不同的标志物，其数量因光谱重叠而受限。

近年来，人们开发出迭代染色技术，通过反复进行抗体孵育和染料失活/抗体洗脱的循环操作，对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片中的数十种标志物进行成像。如今，这些操作可借助自动化设备来完成。

单分子荧光原位杂交（smFISH）是一种定量检测mRNA的技术。它将大量荧光标记的寡核苷酸探针与FFPE切片中的特异性靶点杂交，然后利用荧光显微镜来观察和定量mRNA分子。

为了增加靶点数量并提高实验准确度，smFISH现已发展为多重容错性FISH（MERFISH）等方法。该方法通过二进制条形码来实现错误检测和校正，可测定单个细胞内数万条RNA分子的拷贝数及空间分布^1-3。

关键应用领域

研究人员之所以选择多重成像技术，主要原因在于这些方法能够观察同一组织样本中多样化的细胞类型、功能状态和相互作用，而传统方法只能表征少量细胞。

Vizgen公司联合创始人George Emanuel博士表示：“多重成像技术的进步主要惠及癌症研究领域，如今科学家们能够更好地绘制肿瘤微环境，监测疾病进展，并了解免疫细胞如何与癌细胞相互作用。”

此外，多重成像技术也广泛应用在神经科学研究中，协助人们区分神经细胞类型，绘制脑神经回路，并探究阿尔茨海默病等神经退行性疾病背后的分子机制。

其他一些应用领域包括免疫学，多重成像技术可分析自身免疫性疾病和感染过程中的免疫细胞分布和激活状态；以及再生医学，该技术可助力干细胞分化研究和组织修复追踪。

“多重成像技术在药理学和药物研发中同样展现出价值，不仅能评估候选药物的疗效，还能检测毒性等非预期影响，” Emanuel谈道。

多重荧光成像平台

• Cell DIVE超多标组织成像解决方案

徕卡显微系统（Leica Microsystems）推出的Cell DIVE解决方案让研究人员能够通过迭代染色和染料失活流程，检测单张FFPE组织切片中的60多种蛋白质生物标志物。

“Cell DIVE是先进的开放式多重成像平台，支持多重全切片成像以及组织样本的单细胞分析。有了Cell DIVE，研究人员可自主选择抗体（包括350多种经过验证的抗体）以及所需的自动化程度，” 空间生物学全球营销经理Betty Yuen-Torres介绍道。

Cell DIVE采集软件现支持Z轴叠加成像，能够更精细地观察细胞结构。结合Aivia人工智能图像分析软件，Cell DIVE能够定量蛋白质表达和评估细胞形态，进而揭示复杂的空间和分子模式。

此外，它还支持多组学工作流程整合，包括自动化RNA染色和成像，以及利用BioAssemblyBot 200进行多轮采集，这款定制的多任务机器人可与Cell DIVE成像仪无缝集成。

• MERSCOPE Ultra™空间成像平台

Vizgen公司推出的MERSCOPE Ultra™空间成像平台能够以单细胞分辨率对多达1,000个定制基因进行定量分析。这个平台基于MERFISH技术，能够在一张玻片上进行3.0 cm²大面积的显微成像，获得亚细胞分辨率的空间转录组数据。

“通过整合二进制条形码，MERFISH确保RNA转录本的精准定量，以更清晰的细节揭示组织中的所有细胞内发生了什么，” Emanuel谈道。“此外，早些时候推出的MERFISH 2.0进一步提升了检测灵敏度，即使面对RNA降解的存档样本或临床样本也能进行高效检测。”

对于希望开展多组学分析的研究人员来说，MERSCOPE目前支持利用寡核苷酸偶联抗体检测多达9种定制蛋白质。随着技术的不断发展，检测数量预计将在近期提升至20-30种。

未来展望

多重荧光成像平台正帮助研究人员回答以下问题：哪些细胞类型在疾病状态下相互作用？哪些信号通路影响疾病病理？异常的信号传导如何改变细胞功能？借助上述平台，研究人员有望将单细胞分辨率的空间分析提升至全新高度。

在选择多重荧光成像平台时，您需要考虑以下因素：

• 您需要检测蛋白质、mRNA还是两者？

• 是否能够检测定制靶点？

• 您需要何种通量水平？

• 您需要何种水平的灵敏度？

• 组织保存是否重要？

• 平台是否易于操作，自动化兼容性如何？

• 平台是否能够适应研究的扩展？

参考文献

1. Chen KH, Boettiger AN, Moffitt JR, et al. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 2015;348(6233):aaa6090. 

2. Moffitt JR, Bambah-Mukku D, Eichhorn SW, et al. Molecular, spatial, and functional single-cell profiling of the hypothalamic preoptic region. Science. 2018;362(6416):eaau5324. doi:10.1126/science.aau5324

3. Cohen L, Halpern A, Blosser TR, et al. Whole-transcriptome-scale and isoform-resolved spatial imaging of single cells in complex tissues. bioRxiv preprint