基于ASPA指导的新方法学（NAMs）read-across危害评估工作流用于系统毒性：以肝脏为关键靶器官的conazole类化合物案例及difenoconazole的PoD推导

《Archives of Toxicology》：Applicability of NAMs to support a read-across based hazard assessment workflow for systemic toxicity: a conazole case study

　　

本研究探讨新方法学（new approach methodologies，NAMs）在read-across方法中的适用性，以预测以肝脏为关键靶器官的系统毒性，并推导目标化合物（target compound，TC）difenoconazole的出发剂量（point of departure，PoD）。八个conazoles被用作源化合物（source compounds，SCs），同时纳入代谢物hydroxyitraconazole和1,2,4-triazole。该案例研究依据RISK-HUNT3R项目中开发的替代安全谱分析算法（Alternative Safety Profiling Algorithm，ASPA）工作流进行构建。使用化学指纹的层次聚类识别了不同SCs与TC的相似性，支持将其纳入read-across分析。一个广泛的NAMs筛选组合，包括核受体报告基因试验、ToxProfiler、Cell Painting PLUS、原代人肝细胞（primary human hepatocytes，PHH）转录组学和H295R类固醇生成试验，被用于表征TC和SCs的生物学活性，并证实基于结构的read-across。在第一轮预测中，最近邻定量read-across方法（基于SCs经异速缩放的人最低观察到不良效应水平（lowest-observed-adverse-effect levels，LOAELs））预测TC的LOAEL为6.57 mg/kg/day，该值与基于in vivo的4.88 mg/kg/day值密切一致。在第二种方法中，NAMs数据被用于预测人等效剂量（human equivalent dose，HED）以及SCs和TC各自的LOAELs，其基于生理基于动力学（physiologically based kinetic，PBK）建模与定量体外到体内外推（quantitative in vitro to in vivo extrapolation，IVIVE）。由NAMs推导的HED约比传统方法得到的LOAELs低十倍。该案例研究说明了合适的（ASPA指导的）方法以及基于NAMs的read-across评估的毒理学适用性，以获得安全/保守的毒性估计。图形摘要：本工作采用逐步流程，使用read-across方法评估目标化合物difenoconazole的系统毒性。

论文解读：基于ASPA指导的NAMs read-across工作流评估conazole类化合物系统毒性

研究背景。化学风险评估需确保安全并减少不良效应。科学、伦理和立法因素推动从传统in vivo动物试验转向新方法学（new approach methodologies，NAMs）。NAMs包括计算毒理学（in silico）、相关体外试验和动力学模型，需整合用于危害与风险评估。眼刺激和皮肤致敏已有国际接受的定义方法，但重复暴露系统毒性缺乏共识。替代安全谱分析算法（Alternative Safety Profiling Algorithm，ASPA）是RISK-HUNT3R项目开发的通用工作流，按危害、吸收、分布、代谢和排泄（absorption, distribution, metabolism, and excretion，ADME）和暴露分层。conazoles广泛用作农用杀菌剂和药物，代谢物1,2,4-triazole持久移动，引发饮用水污染担忧。conazoles抑制真菌ERG11（CYP51），破坏麦角固醇合成。研究人员选difenoconazole为目标化合物（target compound，TC），假设缺乏相关动物/人数据，基于其与已知肝毒性conazole源化合物（source compounds，SCs）相似进行read-across，肝脏为关键靶器官；还测试两个代谢物和三个不同作用模式（mode of action，MoA）对照。

研究人员按ASPA工作流开展proof of concept，整合结构、in silico、高通量（high-throughput，HT）体外和生理基于动力学（physiologically based kinetic，PBK）与定量体外到体内外推（quantitative in vitro to in vivo extrapolation，IVIVE）。结果显示，最近邻（k-nearest neighbour，kNN）read-across预测TC的LOAEL_RAX为6.57 mg/kg/day，接近in vivo LOAEL_allom 4.88 mg/kg/day；NAM推导人等效剂量（human equivalent dose，HED）0.43 mg/kg bw/day，约低十倍。研究表明基于NAMs的read-across可获得保守系统毒性估计并减少动物试验。论文发表在《Archives of Toxicology》。

关键技术方法（≤250字）。研究采用分层测试：Tier 1用SMILES、Morgan/MACCS指纹、Tanimoto相似性和层次聚类，以及Danish (Q)SAR、化学效应预测器（Chemical Effect Predictor，CEP）和CYP19A1分子对接；Tier 2用23项CALUX?报告基因、ToxProfiler应激报告、HepG2 Cell Painting PLUS（CPP）、原代人肝细胞（primary human hepatocytes，PHH；10 donor pool，BioIVT）TempO-Seq?转录组学联合PHH-TXG-MAPr、H295R类固醇生成；Tier 3在需要时精炼出发剂量（point of departure，PoD）。ADME/动力学包括Caco-2渗透性、肝细胞代谢、VIVD、Simcyp PBK、IVIVE和反向剂量学；数据整合用kNN。

研究结果。（1）ASPA工作流提供指导：按分层方法整合NAMs数据。（2）基于现有数据和in silico分析：化学相似性显示TC与propiconazole最相似，其次epoxiconazole等；CEP提示肿瘤、生殖、内分泌和肝胆信号；Danish QSAR提示AR拮抗、RAR抑制和PXR激活；CYP19A1对接提示TC可干扰芳香化酶。（3）高通量体外试验评估：CALUX?中TC与propiconazole等聚类，共享AR、PR抑制和PXR激活；ToxProfiler中TC最相似propiconazole和epoxiconazole，见ER、氧化和细胞周期应激；CPP中所有conazoles影响线粒体；PHH转录组学中TC与propiconazole、prothioconazole相似，胆固醇代谢最敏感；H295R中TC降低17β-estradiol；所有HT联合分析显示TC与所有SCs聚类，代谢物和对照分开，1,2,4-triazole无活性被排除。（4）动力学评估和HED推导：所有conazoles高蛋白结合（≥90%），肝清除慢；PBK预测总及游离C_max；最低效应浓度一致在CALUX?最低；反向剂量学得HED，除prothioconazole外均低于in vivo LOAEL_allom。（5）数据整合和read-across分析：kNN预测LOAEL_RAX 6.57 mg/kg/day，接近实际4.88；worst-case得0.83 mg/kg/day，约低六倍；NAM HED 0.43 mg/kg bw/day，约低十倍。

讨论认为该案例是proof of concept，范围限于重复暴露系统毒性、肝为关键靶器官，不包括生殖、发育和致癌。结构相似性和in silico是SCs选择起点，但QSAR受适用域限制。HT数据总体支持TC与SCs共享生物活性，不同平台结果不完全一致，需联合整合。kNN直接预测接近实际，反向剂量学不确定性较大；worst-case保守。HED故意保守，PBK可能低估清除并高估内部浓度。论文结论翻译：本研究说明在ASPA工作流框架下，基于NAMs的read-across方法估计化学类别内系统毒性的效用。将生物学谱与化学结构和in silico方法整合，支持SCs选择。平衡试验组合涵盖广泛无偏谱（转录组学、CPP）和通路特异性终点（CALUX?、ToxProfiler），对机制论证至关重要。整合read-across改善SC选择，并在无额外动物试验下推导保守人相关PoD。但监管所需最低试验集、生物学覆盖和一致性标准仍缺共识，此类案例对构建证据基础重要。需在更大、化学多样性更高的化合物集上验证，并纳入靶器官特异性细胞类型。本评估限于重复暴露系统毒性，肝为关键靶器官；生殖、发育和致癌终点未评估，推导PoD不应应用于这些终点。该案例提供了NAMs框架支持系统毒性评估并减少动物试验依赖的示例。