胞葬作用触发的巨噬细胞蛋白质组重编程揭示Adgre5/CD97为新型凋亡细胞受体

《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：Efferocytosis triggered proteomic reprogramming of macrophages reveals CD97 as a novel apoptotic receptor

在人体健康细胞更新的日常过程中，数十亿细胞发生凋亡。这些细胞由吞噬细胞即巨噬细胞通过胞葬作用（efferocytosis）清除；该过程触发细胞内一系列重编程事件，使细胞向促消退或“伤口愈合”表型转变。迄今为止，尚无研究尝试从蛋白质组学角度研究这些表型变化。在此，研究人员提出一种新颖且稳健的工作流程，用于研究胞葬作用后骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）和肺泡巨噬细胞的蛋白质组和分泌蛋白质组变化，该流程采用细胞培养中氨基酸稳定同位素标记（SILAC）结合数据非依赖采集（DIA）质谱。利用该工作流程，研究人员剖析了BMDMs和凋亡细胞的混合蛋白质组，以绘制胞葬作用后期巨噬细胞中发生的重编程事件。具体而言，研究人员鉴定了黏附G蛋白偶联受体Adgre5/CD97为一种新型胞葬作用相关蛋白，并证明这一进化保守蛋白在小鼠、人和果蝇巨噬细胞摄取凋亡细胞（ACs）中发挥作用。此外，研究人员证明CD97可能与其他胞葬作用受体如MerTK一起作为ACs的共受体。研究结果提供了巨噬细胞胞葬作用景观的前所未有视角，并将有助于在免疫稳态和炎症性疾病的更广泛背景下进一步理解这一重要免疫学过程。

论文解读：胞葬作用触发的巨噬细胞蛋白质组重编程揭示Adgre5/CD97为新型凋亡细胞受体

研究背景：人体健康细胞更新每日清除数十亿凋亡细胞。巨噬细胞通过胞葬作用（efferocytosis，吞噬清除凋亡细胞的过程）清除凋亡细胞（apoptotic cells，ACs）。该过程对组织稳态和炎症消退至关重要，维持免疫耐受并防止ACs释放自身抗原引发自身免疫。胞葬作用失调与自身免疫和炎症性呼吸疾病相关。巨噬细胞表达模式识别受体识别“eat-me signals”如磷脂酰丝氨酸，触发吞噬；胞葬后获得M2样或促消退表型，TGFβ1上调，分泌因子可诱导上皮细胞和成纤维细胞伤口愈合表型。然而，胞葬作用重编程的分子机制理解有限。已有转录组研究关注早期胞葬，但从蛋白质组角度映射胞葬细胞表型尚无研究。因此研究人员采用蛋白质组学方法研究骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）和肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages，AMs）吞噬凋亡Jurkat细胞后的变化，旨在深入理解分子机制及不同巨噬细胞亚型间的保守性。该研究发表于《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》。

关键技术方法：研究人员采用细胞培养中氨基酸稳定同位素标记（SILAC）结合数据非依赖采集（DIA）质谱，分析BMDMs和AMs吞噬凋亡Jurkat细胞后的蛋白质组与分泌蛋白质组；以流式细胞术、共聚焦和超分辨显微镜评估胞葬作用和蛋白定位；用CRISPR/Cas9构建CD97敲除THP-1细胞；用BioID邻近标记检测CD97与MerTK邻近关系；并用果蝇（Drosophila melanogaster）Cirl敲除模型进行体内验证。样本来源包括C57BL/6J小鼠骨髓和支气管肺泡灌洗液（BALF）、THP-1细胞、Jurkat细胞及果蝇。

研究结果：
BMDMs undergo extensive proteome changes following efferocytosis：研究人员建立BMDMs吞噬凋亡Jurkat细胞模型，用SILAC+DIA质谱。30 min为对照，18 h为胞葬条件。鉴定轻通道7170个小鼠蛋白，重通道5404个人蛋白，AC来源蛋白减少或消失。18 h与30 min比较，387个蛋白倍数变化>1.5，288个
Ex vivo alveolar macrophages exhibit a similar reprogramming profile to BMDMs：研究人员从BALF分离AMs，用GM-CSF培养，流式验证纯度，共聚焦证明其吞噬ACs。SILAC显示AMs胞葬后也发生显著蛋白质组变化。BMDMs与AMs中倍数变化>2的上调和下调蛋白Pearson相关系数r=0.6；多个显著上调蛋白在两者间共享，但增加幅度不同。结论：不同巨噬细胞亚型重编程相对保守。

The efferocytic supernatant can alter the phenotype of na?ve BMDMs：研究人员用18 h对照条件培养基（cCM）或胞葬条件培养基（eCM）处理na?ve BMDMs 48 h。PCA显示cCM和eCM处理细胞分离。eCM处理增加275个、减少556个蛋白。GO富集溶酶体降解和蛋白聚糖降解。eCM处理与原始胞葬BMDMs共享Adgre5、Clec4d、Edil3、Thbs1、Fn1等上调蛋白。凝血补体、ECM、血小板激活相关蛋白增加，如Pf4/Cxcl4；Arg2和Ym1增加。结论：胞葬巨噬细胞分泌因子可重编程邻近细胞，形成促消退反馈。

CD97/Adgre5 is a novel efferocytosis-associated protein：CD97/Adgre5在BMDMs和AMs胞葬后及eCM处理后显著增加，Western blot验证蛋白增加，mRNA也增加。CD97是七次跨膜受体，含EGF样域，此前未显示参与胞葬。研究人员在THP-1细胞中构建CD97敲除，发现CD97-KO巨噬细胞AC摄取显著减少，细菌和硅珠摄取无变化。CD97-Fc融合蛋白不直接结合ACs。WT与CD97-KO稳态蛋白质组差异不大，但MerTK、Stab1、CD300A减少；流式显示MerTK表面表达降低，CD14轻度降低；qPCR显示mRNA无显著变化，提示CD97可能稳定MerTK表面表达。超分辨显微镜显示BMDMs前缘MerTK和CD97共染。BioID显示CD97-BirA与MerTK邻近。结论：CD97是新型胞葬相关蛋白，可能作为共受体与MerTK合作促进AC摄取。

The role of adhesion class GPCRs is conserved in Drosophila：研究人员在果蝇中鉴定Cirl/Latrophilin为CD97最佳直系同源物，不含EGF样域。Cirl在胚胎巨噬细胞表达。用CharON和Srp-GMA在Cirl敲除背景，Cirl-KO胚胎巨噬细胞内化和消化ACs减少，但内化/消化比率不变。结论：CD97/Cirl进化保守参与AC摄取，EGF样域缺失不限制该功能。

讨论部分总结：该研究首次成功映射巨噬细胞胞葬后全局蛋白质组变化。SILAC可有效分离小鼠和人蛋白质组，结合DIA质谱提供深度覆盖，并兼容翻译后修饰研究。研究识别多个已知胞葬蛋白如CD14、Thbs1、Mfge8、Slc7a11、Edil3，以及M2极化相关Arg2；抗原加工提呈和促炎分子如MMP12、Clec12a减少。eCM使na?ve BMDMs向胞葬表型转变，ECM、补体和凝血、血小板激活相关蛋白增加。CD97和果蝇Cirl参与AC摄取；CD97不直接结合ACs，可能稳定MerTK表面表达，形成“efferocytic platform”。CD97在THP-1稳态高表达，在BMDMs稳态低、胞葬后上调，可能对后期胞葬重要。M1/M2范式较简化。该工作流可应用于患者ex vivo巨噬细胞，帮助理解胞葬缺陷相关疾病。

研究结论翻译：研究数据提供了对BMDMs清除ACs后表型的全面蛋白质组学检查，并显示这些细胞分泌的因子可对na?ve细胞施加额外的促消退效应，类似替代激活状态。研究结果还强化了典型M1/M2巨噬细胞范式在描述原位复杂动态环境时相对简化的观点。值得注意的是，该新颖且稳健的工作流程可应用于从已知存在胞葬缺陷疾病患者中分离的ex vivo巨噬细胞，从而有助于更好地理解这一重要免疫学过程的蛋白质组景观。