基因组学解析巴西花生(Arachis pintoi)接种菌慢生根瘤菌及其新种Bradyrhizobium boddeyi sp. nov.的鉴定

《Journal of Soil Science and Plant Nutrition》：Genomic Characterization of Bradyrhizobium Strains Used As Inoculants for the Neotropical Legume Arachis pintoi and the description of Bradyrhizobium boddeyi sp. nov

　　

目的：本研究旨在通过比较基因组学和共生分析，对巴西目前推荐用于花生(Arachis pintoi)的慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)菌株进行表征。此外，本研究旨在扩展对花生属(Arachis)相关慢生根瘤菌多样性、进化及细菌共生特性的认识，同时提供强有力的分类学证据，以支持描述一株分离自花生属根瘤的慢生根瘤菌新种。 方法：基于16S rRNA基因和利用116个单拷贝核心基因序列进行系统发育基因组学(phylogenomics)重建。开展平均核苷酸一致性(Average Nucleotide Identity, ANI)分析，以评估菌株BR 1432?、BR 1433和BR 14999与1,301个参考慢生根瘤菌基因组（包括所有可用的模式菌株）的基因组相关性。结果通过数字DNA–DNA杂交(digital DNA–DNA hybridization, dDDH)进行验证。其他分析包括共生基因(nodC和nifH)的系统发育重建、反硝化途径评估及表型表征。 结果：基于16S rRNA基因序列和全基因组数据的系统发育分析表明，菌株BR 1432?和BR 14999在慢生根瘤菌属内形成一个独立谱系，与BR 1433明显分离，后者与巴西慢生根瘤菌(Bradyrhizobium brasilense)聚类。BR 1432?和BR 14999与其最相近的模式菌株（包括湛江慢生根瘤菌(B. zhanjiangense) LMG 29279?）之间的ANI和dDDH值分别低于物种划分阈值96%和70%，支持提出一个新种。此外，公开可用的RefSeq基因组慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium) sp. DN5和Rc2d被发现与BR 1432?密切相关。nodC和nifH基因的系统发育分析揭示了不同的进化模式，而基因组分析表明，所提出的新种拥有完整的反硝化途径，这与菌株BR 1433不同。此外，表型表征揭示了碳源利用和酶活性方面的差异。 结论：基于基因组、系统发育和表型证据，菌株BR 1433被鉴定为巴西慢生根瘤菌(B. brasilense)的成员，而菌株BR 1432? (= UCCC 277? = LMG 34120? = CCP577?)、BR 14999、DN5和Rc2d代表了慢生根瘤菌属内的一个新种，为此提出新种名称Bradyrhizobium boddeyi sp. nov.。

一、研究背景与科学问题

慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)是古老的α-变形菌纲成员，广泛分布于除南极洲外的各大洲。该属多数物种能与豆科植物建立共生关系，通过根瘤形成和高效生物固氮(biological nitrogen fixation, BNF)发挥作用，是农业上最重要的固氮菌属之一。在南美洲，仅大豆种植中每年估计施用超过1.5亿剂基于慢生根瘤菌的接种剂。除粮食生产系统外，慢生根瘤菌在饲用豆科植物和绿肥作物中也发挥重要作用，显著贡献于土壤肥力和低投入农业系统的可持续性。

热带地区将饲用豆科植物整合到禾本科牧草为基础的放牧系统中，是增加生物氮输入和改善肉牛生产的重要策略。花生(Arachis pintoi)是原产于新热带区的饲用豆科植物，在混播牧草中具有巨大潜力。尽管巴西已有商业化根瘤菌接种剂用于花生，但该物种的栽培面积仍有限，其根瘤菌多样性和生物固氮对牧草生产力及牧场可持续性的贡献仍知之甚少。值得注意的是，田间试验表明接种可使地上部干重比不接种对照增加约60%，春季生物固氮可贡献花生植株总氮量的65%。

巴西官方推荐两株慢生根瘤菌作为花生的商业接种菌：MGAP 13 (= BR 1433; SEMIA 6439)和NC 230 (= BR 1432?; SEMIA 6440)。前者分离自巴西米纳斯吉拉斯州的塞拉多(Cerrado)土壤，后者于20世纪80年代由美国北卡罗来纳州立大学研究人员从阿根廷北部花生属自然生境中分离获得。尽管两株菌具有重要农艺价值和长期商业应用，其分类地位一直悬而未决。研究人员假设这些接种菌株代表慢生根瘤菌属内不同的进化谱系，可能包含此前未描述的物种，比较基因组分析将揭示其系统发育关系、共生特性和氮代谢特征。

二、研究内容与主要结论

本研究旨在利用基于基因组的方法确定菌株BR 1432?和BR 1433的分类学地位，并因BR 1432?代表新种而提出慢生根瘤菌属内新种的描述，命名为B. boddeyi。

三、关键技术方法

研究人员对三株菌(BR 1432?、BR 1433和BR 14999)进行牛津纳米孔(Oxford Nanopore)长读长全基因组测序和组装。基于16S rRNA基因(923 bp比对)和116个单拷贝核心基因(25,078个氨基酸位点)进行最大似然法系统发育重建。利用FastANI计算与1,301个RefSeq慢生根瘤菌基因组的平均核苷酸一致性(ANI)，并通过TYGS平台计算数字DNA–DNA杂交(dDDH)值验证。共生基因nodC和nifH的系统发育分析采用IQ-TREE完成。反硝化途径基因比较通过BV-BRC平台的比较系统服务进行。表型表征包括API 20NE和Biolog GN III微板测定、抗生素敏感性测试、反硝化气体产物气相色谱检测及透射电镜观察。温室共生有效性试验在Leonard罐中进行，供试寄主包括花生、大翼豆(Macrotyloma axillare)、木豆(Cajanus cajan)和卵叶山蚂蝗(Desmodium ovalifolium)。

四、研究结果

基因组特征：BR 14999和BR 1433基因组分别为8.7和8.8 Mb，BR 1432?基因组超过9.4 Mb，与慢生根瘤菌属常见基因组大小(约7至10 Mb以上)一致。GC含量方面，BR 1432?和BR 14999约为63%。BR 14999的组装仅含两个scaffold，其中一个279,664 bp的推定质粒具有较低GC含量(60.0%)，携带repABC质粒分配基因、插入序列和整合酶，但缺乏结瘤和固氮基因，这些基因仅定位于推定染色体上。

16S rRNA分析：16S rRNA基因系统发育恢复了慢生根瘤菌属内两个主要类群，即大豆慢生根瘤菌(B. japonicum)超枝(I)和埃氏慢生根瘤菌(B. elkanii)超枝(II)。BR 1433聚类于B. elkanii超枝，与巴西慢生根瘤菌(B. brasilense)等多个物种聚在一起；BR 1432?则位于B. japonicum超枝，与湛江慢生根瘤菌(B. zhanjiangense) CCBAU 51778?、菌株BR 14999以及GenBank中两株未描述菌株(Rc2d和DN5)最为接近。

系统发育基因组学、ANI和dDDH分析：基于116个单拷贝核心基因的系统发育基因组学分析清楚表明，两株商业接种菌在遗传上截然不同。BR 1433与20个基因组共享>96% ANI，包括B. brasilense UFLA03-321?，与后者的dDDH值为73.9%，确认属于同一物种。BR 1432?仅与巴西菌株BR 14999高度相似(98.85% ANI)，与最近描述种B. zhanjiangense CCBAU51778?的ANI为95.33%，dDDH为65.8%，低于物种划分阈值。菌株DN5(96.99% ANI)和Rc2d(96.28% ANI)与BR 1432?的ANI值高于96%，且四株菌间dDDH值均高于70.9%，表明它们属于同一基因组物种。

反硝化途径的计算机分析：反硝化相关基因的分布显示，同化型硝酸盐还原酶基因(nasA)和周质硝酸盐还原酶基因(napA)在属内广泛分布，而呼吸型硝酸盐还原酶基因(narG)、亚硝酸盐还原酶(nirK)、一氧化氮还原酶基因(norB和norC)及氧化亚氮还原酶基因(nosZ)分布异质性较大。BR 1433仅含nasA基因，缺乏完整反硝化所需基因。相反，BR 1432?、BR 14999、DN5和Rc2d四株菌共享完全相同的反硝化基因谱，包含nasA、napA、nirK、norB、norC和nosZ，代表完整的反硝化途径，具备将硝酸盐依次还原为亚硝酸盐、一氧化氮、氧化亚氮直至氮气的遗传潜力。反硝化基因分布与系统发育亲缘关系关联性强于地理来源。

nod和nif基因系统发育：基于nodC核苷酸(1200 nt)和NodABC串联氨基酸的系统发育显示，BR 1433与巴西慢生根瘤菌(B. macuxiense)关系更近而非B. brasilense(<90%核苷酸一致性)；nifH系统发育中BR 1433与B. macuxiense和B. mercantei聚簇。BR 1432?和BR 14999在nodC和NodABC系统发育中与未表征的Bradyrhizobium sp. SMVT-02(>93%一致性)关系最近，其次为B. stylosanthis BR 446?(90%)、B. iriomotense NBRC 102520?和B. manausense BR 3351?(<90%)。值得注意的是，尽管DN5和Rc2d与BR 1432?和BR 14999属于同一基因组物种，但其nodC和nifH基因与后两者的一致性低于75%，体现了核心基因组与共生基因座之间的不一致性，反映了共生基因通过水平基因转移和同源重组塑造的进化动态。BR 1433和BR 1432?/BR 14999形成的两个独立谱系均与已描述symbiovar的一致性低于90%，无法归属于任何已确认的symbiovar。

五、讨论与结论

反硝化基因分布与系统发育关联性强，表明反硝化能力在特定慢生根瘤菌谱系中进化保守，基因获得和丢失事件促成了属内反硝化模块的异质性分布。B. boddeyi中鉴定出的完整反硝化途径与B. diazoefficiens相似，可能在低氧条件下赋予生态优势，同时通过NosZ活性促进氧化亚氮(N?O)排放的减少。BR 1433属于B. brasilense但可能代表与该物种最初描述菌株不同的symbiovar。虽然三株菌均可结瘤相似的豆科寄主，但其nod和nif基因的结构和系统发育谱差异显著，表明存在不同的共生适应性，各菌株中nod和nif聚簇的共分化模式指向塑造其共生能力的独立进化压力，对寄主兼容性和环境适应具有潜在影响。

结论：基于基因组、系统发育和表型证据，菌株BR 1433被鉴定为B. brasilense的成员，而菌株BR 1432? (= UCCC 277? = LMG 34120? = CCP577?)、BR 14999、DN5和Rc2d代表慢生根瘤菌属内的一个新种，为此提出新种名称Bradyrhizobium boddeyi sp. nov.。