精准碱基编辑突变激活的隐蔽3′剪接受体位点以纠正β654-地中海贫血的RNA剪接缺陷

《Molecular Biomedicine》：Precision base-editing of the cryptic 3’ acceptor site to correct the RNA splicing defect of β654-thalassemia

β-地中海贫血（β-thalassemia）是全球最常见遗传性疾病之一，由影响β-珠蛋白（β-globin）产生的突变引起。β654突变（IVS2-654，C＞T）是汉族人群中最高频的β-地中海贫血等位基因之一，其激活隐蔽3′剪接位点（cryptic 3′ splice site）并导致异常RNA剪接。既往研究表明，由于合适单导RNA（single-guide RNA，sgRNA）无法有效靶向该位点，直接碱基编辑IVS2-654突变具有挑战性。研究人员转而靶向突变激活的隐蔽3′剪接受体位点而非致病突变本身。研究人员先在β654-地中海贫血小鼠模型中利用CRISPR-Cas9介导的同源定向修复（homology-directed repair，HDR）引入该隐蔽剪接位点的碱基置换，恢复正常RNA剪接，验证治疗原理。随后通过将Td-CBEmax mRNA与靶向隐蔽剪接受体位点的sgRNA显微注射至单细胞胚胎，获得碱基编辑β654小鼠。活产β654小鼠中78%实现碱基编辑，其中86%产生正确剪接的β-珠蛋白转录本。正常RNA剪接恢复伴随大多数碱基编辑创始鼠及其子代血液学参数和组织病理学改善。上述结果证明突变激活的隐蔽剪接位点可作为精准碱基编辑的治疗可作用靶点，并为纠正β654-地中海贫血异常RNA剪接提供概念验证。

论文解读：《Molecular Biomedicine》发表研究——靶向突变激活的隐蔽3′剪接受体位点的精准碱基编辑纠正β⁶⁵⁴-地中海贫血RNA剪接缺陷

研究背景方面，β-地中海贫血（β-thalassemia）由β-珠蛋白基因（HBB）致病性变异导致β-珠蛋白合成减少或缺如，汉族人群中IVS2-654（C＞T）突变通过生成异常5′剪接供体位点并激活下游隐蔽3′剪接受体位点，造成严重成熟β-珠蛋白合成不足。现有治疗如输血、铁螯合、异体造血干细胞移植存在局限；基因突变非依赖策略如γ-珠蛋白诱导和慢病毒HBB添加不直接恢复内源HBB；核酸酶策略依赖DNA双链断裂（double-strand break，DSB），可产生插入缺失（indel）、染色体重排等不可预测结果；直接碱基编辑IVS2-654又受原型间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）和可编辑窗口限制。因此，需要无DSB且精准的策略修饰已验证的隐蔽剪接靶点。

研究人员开展的研究是：先以CRISPR-Cas9与单链寡脱氧核苷酸（ssODN）做HDR，验证IVS2-579_580（GG＞AA）置换可恢复剪接；再用胞嘧啶碱基编辑器Td-CBEmax联合sgRNA-3，在β⁶⁵⁴小鼠受精卵水平进行无DSB碱基编辑；并通过细胞、小鼠模型、血液学、组织学与全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）评估疗效与特异性。结论为：精准编辑突变激活的隐蔽3′剪接受体位点可恢复规范剪接、恢复内源β-珠蛋白表达、改善贫血与脾肝病变，且基因组范围脱靶风险低；该策略把“剪接缺陷矫正”从核酸酶验证推进到精准碱基编辑框架，对β⁶⁵⁴-地中海贫血及类似剪接病具有概念验证意义。

主要关键技术方法概括：研究人员使用HEK293T细胞系评估sgRNA与Td-CBEmax在靶/脱靶表现；使用Jackson Laboratory提供的β⁶⁵⁴-地中海贫血小鼠模型，经β⁶⁵⁴雄鼠与野生型（wild-type，WT）雌鼠交配获取受精卵；以CRISPR-Cas9/ssODN实施HDR验证，以Td-CBEmax mRNA+sgRNA-3显微注射实施碱基编辑；以靶向深度测序、WGS、RT-PCR、高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）、血象分析与组织染色评价编辑效率、剪接恢复、蛋白表达与病理表型；样本队列来源为β⁶⁵⁴小鼠、WT小鼠、β^654?HDR鼠、β^654?BE鼠及F1子代。

研究结果部分，小标题与结论如下。The cryptic 3′ splice acceptor site serves as an alternative therapeutic target for correcting the RNA splicing defect in β⁶⁵⁴ mice：研究人员用sgRNA-1、Cas9 mRNA和含IVS2-579_580（GG＞AA）的ssODN显微注射受精卵，获得6只携带预期置换的创始鼠，RT-PCR显示所有HDR鼠均出现正确剪接β-珠蛋白转录本，证明隐蔽3′剪接受体位点单独修饰即可恢复规范剪接。Base editor Td-CBEmax efficiently modifies the cryptic 3′ splice acceptor site in HEK293T cells：研究人员将sgRNA-3/sgRNA-4分别与Td-CBEmax质粒转染HEK293T细胞，sgRNA-3靶位C•G-to-T•A合并频率45.55%，选定sgRNA-3；前十预测脱靶位点仅一个基因间区位点低频编辑，WGS未见广泛脱靶与indel，证明在细胞中高效且特异。Td-CBEmax efficiently edits the cryptic 3′ splice acceptor site in β⁶⁵⁴ mice：研究人员将sgRNA-3与Td-CBEmax mRNA注射β⁶⁵⁴×WT受精卵，活产鼠中19%带β⁶⁵⁴等位基因，其中78%检出靶位编辑；深度测序显示多数鼠β⁶⁵⁴等位基因发生胞嘧啶转换，也存在G＞T/G＞C旁观者编辑，创始鼠呈嵌合基因型。Base editing restores normal β-globin RNA splicing and endogenous β-globin expression in β⁶⁵⁴ mice：RT-PCR显示7只β^654?BE中6只出现399 bp正确剪接条带，F1子代可传代恢复剪接；IVS2-579 G＞A/T/C及GG＞AA均可能消除隐蔽位点识别；HPLC在5只鼠检出人β-珠蛋白，证明内源表达恢复。Base editing ameliorates the hematological abnormalities of β⁶⁵⁴-thalassemia mice：研究人员比较β⁶⁵⁴与β^654?BE外周血参数，血红蛋白由84.6 g/L升至151.3 g/L，红细胞计数、血细胞比容、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白显著改善，网织红细胞由26.2%降至4.7%，血涂与骨髓涂异常减轻。Base editing ameliorates splenomegaly and histopathological abnormalities in β^654?BE mice：β⁶⁵⁴鼠脾大、红白髓结构紊乱、铁沉积明显；β^654?BE鼠脾系数下降，脾红白髓分界恢复，脾与肝普鲁士蓝染色铁负荷减少。Therapeutic effects of base editing are transmitted to the offspring of β^654?BE mice：β^654?BE与WT交配所得F1中，β⁶⁵⁴子代存活率37.5%高于对照29.03%，F1 β^654?BE红细胞指标与WT无显著差异，随访超一年无HBB位点相关病理。Whole-genome sequencing supports the in vivo specificity of Td-CBEmax editing in β^654?BE mice：研究人员对6只β^654?BE脾组织与4只未处理β⁶⁵⁴对照做WGS，SNV/indel总数无组间差异；650个候选脱靶区间中仅βBE1有5个基因间区变异，提示体内特异性良好。

讨论部分总结：研究人员指出本研究在既往核酸酶删除异常剪接元件与HDR精确改造基础上，进化为无DSB、可预测的单碱基框架；策略核心是改“致病突变本身”为“突变激活的病理剪接事件”，避开IVS2-654直接编辑的PAM限制并保留内源HBB调控；特异性上碱基编辑降低大片段重排与p53 DNA损伤反应风险，但仅部分编辑基因型具功能收益，旁观者编辑在其他背景可能有害；局限包括受精卵模型不等于人造血干细胞/祖细胞（HSPC）离体编辑移植、WGS样本量有限、缺转录组范围RNA脱靶与剪接组分析、仅单一突变；该概念可拓展至IVS2-705、IVS2-745等其他激活隐蔽位点的遗传病，但需逐突变评估。

结论部分原文意译：综上，本研究显示Td-CBEmax对突变激活隐蔽3′剪接受体位点的精准碱基编辑，可在β⁶⁵⁴-地中海贫血小鼠中恢复正常β-珠蛋白RNA剪接并大幅挽救疾病表型；研究在既往核酸酶验证之上，把隐蔽剪接位点矫正推进为定义明确、无DSB的碱基编辑框架；通过靶向异常RNA加工分子事件而非直接修正致病突变，该策略在保留内源HBB基因调控与局部基因组架构的同时克服重要靶向限制；结果为突变激活隐蔽剪接位点的精准碱基编辑提供概念验证，并为β⁶⁵⁴-地中海贫血及其他异常RNA剪接遗传病的后续治疗开发奠定基础。