急性暴露于Chattonella marina复合体下黄尾鰤（Seriola quinqueradiata）多器官组织病理学评估揭示鳃主导性改变

《Fisheries Science》：Multiorgan histopathological assessment reveals gill-predominant changes in yellowtail (Seriola quinqueradiata) during acute exposure to the Chattonella marina complex

　　

由针胞藻（raphidophyte）Chattonella marina complex（以下简称Chattonella）引起的赤潮尽管已有现行缓解措施，仍对水产养殖构成威胁。虽然已报道Chattonella暴露期间的鳃损伤，但在急性终末前期主要鳃外器官是否出现明显组织病理学异常仍不清楚。研究人员检查了黄尾鰤（Seriola quinqueradiata）在急性Chattonella暴露开始后60 min的生理和组织学反应。首先基于血液氧分压（blood partial oxygen pressure, pO₂）、血浆pH以及血浆Na⁺、K⁺和Ca²⁺浓度评估生理扰动，随后对鳃、心脏、肝脏、肾脏、头肾、脾、肠和胃进行系统组织学检查，包括被报道受其他有害藻暴露影响的器官。暴露鱼显示血液pO₂降低、测得血浆pH降低以及测得血浆Na⁺、K⁺和Ca²⁺浓度升高。在本急性暴露条件下，明显的苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）可检测异常以鳃为主，其特征为次级鳃小片（secondary lamellae）基部上皮脱离，而在该采样点所检查的其他器官中未鉴定出明显H&E可检测异常。这些发现表明，Chattonella暴露具有独特的急性反应特征，表现为血液参数改变和以鳃为主的组织病理学，而所检查的主要鳃外器官无明显H&E可检测异常。

有害藻华（harmful algal blooms, HABs）在全球范围内对水产养殖构成严重威胁，可引发养殖鱼大量死亡。针胞藻（raphidophyte）Chattonella marina complex（以下简称Chattonella）在欧洲、大西洋及尤其亚太地区频繁暴发，并对水产养殖造成损害。尽管监测和理化控制技术已有发展，但赤潮损害仍持续存在，因此需要新的补充策略，包括增强养殖鱼对赤潮暴露的抵抗性。黄尾鰤（Seriola quinqueradiata）是日本海水养殖的重要养殖鱼种，也反复被报道为受Chattonella赤潮影响的主要物种，因此被广泛用作研究Chattonella暴露效应的模型。实践管理中，临时停食常用于降低赤潮暴发期间鱼类死亡率；近期黄尾鰤研究表明停食可改善Chattonella暴露下的存活。此外，黄尾鰤对赤潮的抵抗性具有可遗传性，并可通过选择育种增强。因此，短期管理措施和长期育种策略均在推进。为进一步发展这些方法，必须详细理解赤潮暴露触发的致死机制。胞外活性氧（reactive oxygen species, ROS），尤其是Chattonella产生的超氧化物，被认为参与其鱼毒性；菌株依赖性超氧化物产生与对黄尾鰤和真鲷的毒性相关，但其在鳃损伤中的直接作用仍未解决。组织层面，既往研究显示Chattonella暴露引起黄尾鰤鳃上皮细胞脱离和水肿；其他鱼类如太平洋蓝鳍金枪鱼（Thunnus thynnus orientalis）和金线鲷（Rhabdosargus sarba）也报道了类似鳃损伤。生理层面，暴露黄尾鰤表现血液氧分压（pO₂）降低、血pH降低和血浆离子浓度（Na⁺、K⁺、Ca²⁺）升高，支持缺氧和离子失调是死亡过程关键驱动因素的假设。然而，这些变化能否仅由鳃损伤解释，或急性暴露期间其他器官损伤是否也参与，仍不清楚。海水硬骨鱼通过多器官协调维持渗透和离子稳态：鳃是酸碱调节和渗透调节的主要器官，但肾和肠也参与；肾排泄二价离子和酸等价物，肠吸收NaCl和水并分泌HCO₃^?，从而沉淀Ca²⁺/Mg²⁺；心脏和肝脏分别支持循环和代谢功能，而脾和头肾是硬骨鱼主要造血和免疫器官。因此，全面多器官分析对准确刻画Chattonella暴露在硬骨鱼中的效应很重要。事实上，暴露于有害藻Pseudochattonella verruculosa与鲑科肾脏和肝脏组织学损伤相关；暴露于Karenia mikimotoi与鲑科胃肠道和肝脏组织病理变化相关，表现为肠上皮固缩/脱落和肝脏多灶性凝固性坏死；此外，将海洋青鳉（Oryzias melastigma）实验暴露于Karenia selliformis会导致肠和肝病理损伤。然而，尚无研究系统检查在表现生理紊乱的黄尾鰤急性终末前期Chattonella暴露中，主要鳃外器官是否存在明显组织病理学异常。因此，研究人员除鳃外，还检查了被报道受其他有害藻暴露影响的肝脏、肾脏和胃肠道（肠和胃），并检查心脏、头肾和脾，以筛查急性暴露期间可能的循环、造血、血管或免疫相关组织病理变化。本研究旨在确定在Chattonella暴露急性终末前期表现生理紊乱的黄尾鰤主要鳃外器官是否存在明显H&E可检测组织病理学异常。研究人员首先用血液参数确认生理扰动，随后系统组织学检查鳃和主要鳃外器官。

关键技术方法概括：研究人员所用黄尾鰤于2024年4月由日本长崎渔业技术研究所Goto Field Station人工授精生产，室内流水紫外灭菌海水养殖至2024年11月；实验时体重472–639 g、全长33.2–36.5 cm，暴露前禁食24 h。使用Chattonella marina complex OP27株。暴露组为稀释Chattonella悬液，对照组为紫外灭菌海水，密度约1000 cells mL^?1，光强10 μmol photons m^?2 s^?1，溶解氧≥6 mg L^?1；共5个对照run和6个暴露run，每run两鱼入100 L槽含60 L水。暴露60 min取一鱼，另一鱼监测存活至180 min或死亡。采集尾血管血、第二鳃弓及心、肝、肾、头肾、脾、肠和胃。血pO₂用i-STAT CG8+测定，血浆pH和Na⁺、K⁺、Ca²⁺用LAQUAtwin口袋计测定；组织石蜡切片H&E染色，盲法检查每器官三非连续切片，鳃量化次级鳃小片基部上皮脱离频率。统计用R 4.4.0，采用Welch t检验、exact Mann–Whitney U检验和Kaplan–Meier log-rank检验。

研究结果部分，研究人员保留原文小标题并总结如下。第一，Chattonella暴露下的存活（Survival under Chattonella exposure）。通过生存监测发现，暴露组生存时间为75–131 min，均值±标准差为109±20 min；对照组全部存活至180 min观察期，并按180 min删失。Kaplan–Meier生存曲线在组间差异显著，log-rank检验χ²=10.26，P=0.00136。该结果表明，在急性暴露条件下暴露鱼发生死亡，且60 min采样点早于观察到的死亡窗口15–71 min。第二，血液生理参数变化（Changes in blood physiological parameters）。通过血液和血浆测量发现，暴露鱼血液pO₂显著低于对照，分别为23.2±2.8 mmHg和38.0±10.8 mmHg，均值差?14.8 mmHg，95%置信区间（confidence interval, CI）为?28.03至?1.57，P=0.0353；测得血浆pH显著降低，分别为7.68±0.13和8.00±0.16，均值差?0.320，95% CI为?0.533至?0.107，P=0.00865。暴露鱼测得血浆Na⁺、K⁺、Ca²⁺浓度显著高于对照：Na⁺为169.6±5.3 mmol L^?1对153.9±5.8 mmol L^?1，均值差15.65 mmol L^?1，95% CI为7.50至23.81，P=0.00224；K⁺为4.77±0.34 mmol L^?1对3.85±0.73 mmol L^?1，均值差0.923 mmol L^?1，95% CI为0.034至1.812，P=0.0442；Ca²⁺为1.63±0.18 mmol L^?1对1.23±0.15 mmol L^?1，均值差0.400 mmol L^?1，95% CI为0.154至0.646，P=0.00580。该结果表明暴露引起血液氧合下降和组间血浆pH及离子浓度差异。第三，组织病理学（Histopathology）。通过H&E组织学检查发现，暴露鱼鳃切片显示次级鳃小片基部上皮脱离；除基部上皮脱离外，60 min未见其他明显鳃异常。特别地，既往报道的弥漫性鳃小片水肿和广泛上皮分离未观察到。在心、肝、肾、头肾、脾、肠或胃中，在当前急性暴露条件下未发现明显H&E可检测异常。基部上皮脱离频率在暴露组显著高于对照组：暴露组中位数为35.90%，四分位距（interquartile range, IQR）为21.84–43.02%；对照组中位数为6.92%，IQR为5.31–8.20%；双侧exact Mann–Whitney U检验P=0.00794，rank–biserial相关系数为1.00。该结果表明，急性暴露早期明显H&E可检测组织病理学以鳃为主，且表现为次级鳃小片基部上皮脱离频率升高。

讨论部分总结：研究人员系统检查了在Chattonella暴露急性终末前期表现生理紊乱的黄尾鰤鳃和主要鳃外器官。本研究主要贡献是评估该急性阶段鳃外器官是否存在明显H&E可检测异常。单独监测的暴露鱼死亡发生在暴露开始后75–131 min，因此60 min采样点早于死亡窗口15–71 min。与对照相比，暴露鱼血液pO₂和测得血浆pH显著降低，测得血浆Na⁺、K⁺、Ca²⁺浓度显著升高。血液pO₂下降表明血液氧合受损，而测得血浆pH和离子浓度差异应解释为组间相对变化，而非酸中毒或离子失调的确定性证据。由于i-STAT测量在鱼类中可能受物种特异性和分析条件影响，测得pO₂主要作为组间相对指标解释，而非确定的绝对值。Ishimatsu et al.发现Chattonella暴露黄尾鰤与血液pO₂降低、血pH降低和血浆离子浓度升高相关；他们通过背主动脉插管采集动脉血，而本研究从尾血管采血；此外，本研究中血浆pH和离子浓度在冻存解冻后测量，血液与磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline, PBS）中肝素钠按10% v/v混合且未事后校正。由于采样和分析程序差异可能影响绝对值，未在两研究间直接比较数值。尽管存在方法学差异，生理反应方向一致：暴露鱼血液pO₂和pH较低，血浆离子浓度较高。然而，本研究的单时间点数据不允许将鱼分配到死亡过程的特定阶段。对照处理未包含OP27培养悬液成分，因此不能排除其可能贡献；所有观察到的反应应解释为全培养悬液效应，而非分离Chattonella细胞效应。暴露开始后60 min的组织学分析显示，H&E可检测的明显异常以鳃为主，表现为次级鳃小片基部上皮脱离。由于鳃是气体交换和离子平衡的主要器官，这种基部脱离可能损害鳃小片上皮完整性，从而促成血液氧合受损以及测得血浆pH和离子浓度的组间差异。既往研究报道Chattonella暴露黄尾鰤和其他鱼类的鳃表现次级鳃小片上皮水肿、上皮分离和上皮脱落。相反，本研究中鳃病变限于基部上皮脱离，未观察到广泛水肿或上皮分离。这种差异可能反映采样时所检查病变阶段的差异。Ishimatsu et al.显示，在低氧血症开始时，鳃与对照形态差异很小，黏液相关阻塞被强调为主要发现，而上皮分离和坏死在濒死阶段变得突出。因此，60 min采样点可能早于水肿和坏死等严重病变的发展。基部上皮脱离也在对照鱼中以低频率观察到，表明其可作为背景变化或处理相关伪影发生。因此，单个鳃小片的基部脱离不被视为Chattonella诱导损伤的特异证据；相反，研究人员在相同组织学处理条件下比较组间病变频率。暴露鱼基部上皮脱离频率显著更高，支持其与Chattonella暴露相关，尽管基部脱离并非暴露鱼独有。虽然在急性Chattonella暴露后60 min主要鳃外器官未发现明显H&E可检测异常，但其他有害藻物种暴露鱼中曾报道鳃外病理，包括自然赤潮或暴发相关野外病例以及24–96 h实验室暴露。这些病变可能代表与延长全身扰动相关的延迟或继发性病理，而非原发早期靶器官效应。由于本研究限于单一急性采样点和常规H&E染色，无明显异常不能排除这些器官的亚细胞、生化、分子、血管、功能或延迟改变。因此，比较不同藻种间器官特异性反应时应考虑暴露持续时间、采样阶段和分析分辨率差异。未来需使用额外采样点以及生化、分子和血管标志物研究以阐明这些可能性。这些发现支持如下模型：在本急性暴露条件下，早期以鳃为主的组织病理学改变可能促成血液氧合受损以及测得血浆pH和离子浓度的组间差异。仍需进一步研究阐明这些鳃改变的机制及与Chattonella暴露相关的更广泛致死过程。

研究结论翻译：这些发现表明，Chattonella暴露具有独特的急性反应特征，表现为血液参数改变和以鳃为主的组织病理学，而所检查的主要鳃外器官无明显H&E可检测异常。这些发现支持如下模型：在本急性暴露条件下，早期以鳃为主的组织病理学改变可能促成血液氧合受损以及所测血浆pH和离子浓度的组间差异；需进一步研究阐明这些鳃改变机制及Chattonella暴露相关的更广泛致死过程。