《Frontiers in Physiology》：Ceramidase is involved in metabolic reprogramming of fibroblasts under hypoxia conditions
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引言：生理性代谢重编程（metabolic reprogramming）是细胞抵抗/对抗应激以维持稳态的策略。缺氧（hypoxia）是重要应激刺激，可促进组织重塑和纤维化，其中鞘脂（sphingolipid）代谢改变可能参与成纤维细胞（fibroblast）反
引言：生理性代谢重编程（metabolic reprogramming）是细胞抵抗/对抗应激以维持稳态的策略。缺氧（hypoxia）是重要应激刺激，可促进组织重塑和纤维化，其中鞘脂（sphingolipid）代谢改变可能参与成纤维细胞（fibroblast）反应。在此，研究人员研究了酸性神经酰胺酶（acid ceramidase，ASAH1；鞘脂补救途径关键酶）在成纤维细胞适应缺氧应激中的潜在作用。方法：将人成纤维细胞暴露于缺氧24、48和72小时，并在使用D-Nmappd药理学抑制酸性神经酰胺酶后研究代谢和氧化还原（redox）变化。这些发现通过分析来自特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）肺的公开bulk和单细胞RNA测序数据集进行补充。结果：缺氧成纤维细胞显示代谢重塑，涉及葡萄糖、氨基酸和氧化还原相关通路，并伴有与适应性抗氧化反应一致的变化，包括GSH/GSSG平衡改变。缺氧下药理学抑制酸性神经酰胺酶与肉碱代谢和长链脂肪酸β-氧化改变、GSH和GSSG水平降低，以及核因子E2相关因子2（Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2，NRF2）、超氧化物歧化酶2（Superoxide dismutase 2，SOD2）和8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶1（8-Oxoguanine DNA Glycosylase 1，OGG1）表达降低相关。在IPF肺组织中，ASAH1表达与糖酵解和氧化还原相关基因相关。单细胞分析显示，表达ASAH1的IPF成纤维细胞富集与缺氧反应和氧化应激调节相关的转录程序，并显示与较少活化表型相关的特征。讨论：总体而言，这些发现提示酸性神经酰胺酶/ASAH1与成纤维细胞对缺氧应激的代谢和氧化还原适应相关，并可能影响IPF中的成纤维细胞活化。
研究背景：细胞代谢重编程（metabolic reprogramming）是细胞对不同刺激（包括缺氧、营养可用性改变、炎症和感染）的生理适应反应，使细胞在应激下维持稳态和功能完整性。鞘脂（sphingolipid）已在多种生理病理情境中参与代谢重编程。鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SPHK1）/鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）轴在缺氧红细胞、镰状细胞病和慢性肾病中调节葡萄糖通量和氧稳态；鞘脂也驱动癌症代谢适应。缺氧是多种病理条件下的重要应激刺激，可促进成纤维细胞（fibroblast）活化和组织重塑，并可利于纤维化发生发展。S1P信号参与促纤维化反应，包括肌成纤维细胞分化和上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）。然而，鞘脂代谢，尤其神经酰胺酶活性，是否参与成纤维细胞对缺氧应激的生理代谢适应仍不清楚。研究人员因此研究酸性神经酰胺酶（acid ceramidase，ASAH1）在成纤维细胞代谢和氧化还原（redox）适应中的潜在作用，结合非靶向代谢组学、药理学抑制及公开IPF肺bulk和单细胞转录组数据，旨在描述缺氧适应中ASAH1相关代谢和转录程序，并探索其与成纤维细胞活化和纤维化重塑的潜在相关性。
主要关键技术方法：研究人员将人成纤维细胞暴露于缺氧（<1% O
2）24、48和72小时，使用酸性神经酰胺酶抑制剂D-Nmappd（5 μM）并进行非靶向超高效液相色谱-高分辨质谱（Ultra-High-Performance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry，UHPLC-HRMS）代谢组学，数据经Compound Discoverer和MetaboAnalyst 6.0处理，进行代谢物集富集分析（metabolite set enrichment analysis，MSEA）和过代表分析（over-representation analysis，ORA）。用MTT评估活力，用流式细胞术检测NRF2、SOD2、OGG1、FAP、αSMA、SPNS2及TMRE、MitoSOX。公共数据方面，分析GSE150910（103例IPF患者肺组织bulk RNAseq）和GSE136831（28例对照和32例IPF患者肺组织scRNAseq），采用Scanpy、UMAP、Leiden聚类、STRING、pseudobulk、PyDESeq2及基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）。
研究结果：
缺氧应激刺激使成纤维细胞重编程为抗氧化特征。通过缺氧24、48、72小时非靶向代谢组学，与常氧对照比较，富集葡萄糖-丙氨酸循环、甘氨酸-丝氨酸循环、谷氨酸、嘌呤、组氨酸和甲基组氨酸、β-丙氨酸代谢等，符合Warburg效应；抗氧化相关代谢物carnosine、L-glutamine、L-histidine、L-serine、ornithine、pantothenic acid、4-pyridoxic acid、homo-L-arginine增加，GSH/GSSG向还原型偏移，细胞活力无改变。结论：缺氧诱导成纤维细胞代谢重编程并保障氧化还原稳态。
药理学抑制酸性神经酰胺酶与缺氧成纤维细胞代谢重塑相关。D-Nmappd处理缺氧成纤维细胞，48小时富集肉碱代谢和长链脂肪酸β-氧化，72小时富集氨基酸代谢，24小时无显著通路；GSH和GSSG降低；流式显示NRF2、SOD2、OGG1降低；溶血磷脂LPC 14:0、15:0、16:0、16:1、p-16:0/0:0、22:6富集，72小时palmitoyl sphingomyelin增加；TMRE阳性趋势增加，MitoSOX阳性显著增加，细胞内乳酸降低。结论：抑制酸性神经酰胺酶与抗氧化和DNA修复改变相关，减少糖酵解依赖，相对转向线粒体氧化代谢。
神经酰胺酶表达与IPF肺代谢转录特征相关：bulk RNAseq分析。分析GSE150910中103例IPF肺组织，ASAH1表达与丙酮酸脱氢酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK3）、乳酸脱氢酶B（lactate dehydrogenase B，LDHB）正相关，与肉碱棕榈酰转移酶1C（carnitine palmitoyltransferase 1C，CPT1C）负相关，与谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）正相关。结论：全肺转录组提示ASAH1与IPF肺组织糖酵解和氧化还原相关转录程序有关。
神经酰胺酶表达与IPF成纤维细胞氧化还原稳态相关转录特征相关：scRNAseq数据分析。分析GSE136831，IPF成纤维细胞ASAH1表达高于对照和其他细胞群；STRING显示IPF成纤维细胞上调376个差异表达转录本，富集细胞外基质组织/重塑；35.9% IPF成纤维细胞表达ASAH1，对照为27%；pseudobulk和GSEA显示ASAH1+ IPF成纤维细胞富集缺氧反应和氧化应激调节程序。结论：ASAH1表达与IPF成纤维细胞缺氧适应和氧化应激调节相关。
神经酰胺酶表达与IPF中较少活化成纤维细胞表型一致的转录特征相关。通过ASAH1+与ASAH1- IPF成纤维细胞差异表达分析，负调控成纤维细胞-肌成纤维细胞转化（fibroblast-to-myofibroblast transition，FMT）的CITED2（Cbp/P300 Interacting Transactivator With Glu/Asp Rich Carboxy-Terminal Domain 2）、SFRP4（Secreted Frizzled Related Protein 4）显著上调，SFRP1（Secreted Frizzled Related Protein 1）、THY（Thy-1 Cell Surface Antigen）、SDC2（Syndecan 2）、RARRES1（Retinoic Acid Receptor Responder 1）呈升高趋势；流式显示缺氧增加αSMA，D-Nmappd进一步增加αSMA；缺氧增加SPNS2（Spinster homolog 2），D-Nmappd降低SPNS2。结论：ASAH1表达与较少活化成纤维细胞转录表型相关，而神经酰胺酶活性改变可能影响缺氧下成纤维细胞活化。
讨论总结：讨论指出ASAH1表达/活性与成纤维细胞缺氧应激代谢适应以及纤维化肺中较少活化表型相关。酸性神经酰胺酶水解神经酰胺生成鞘氨醇，进入鞘脂补救途径并可磷酸化为S1P，其生物学效应高度依赖细胞和病理背景。代谢组显示未处理缺氧成纤维细胞富集糖酵解适应、氧化还原稳态和抗氧化代谢；D-Nmappd抑制后转向肉碱代谢和长链脂肪酸β-氧化，并伴膜脂重塑。Bulk RNAseq中ASAH1与PDK3、LDHB正相关，与CPT1C负相关，与GPX4正相关；GSH降低可能与GPX4功能受损和氧化应激增加有关，而缺氧对照GSH增加可能维持氧化还原稳态；但需直接测量ASAH1和GPX4酶活以建立机制联系。scRNAseq中，35.9%纤维化成纤维细胞表达ASAH1，ASAH1阴性/无活性状态可能促进病理/增殖/促纤维化表型；ASAH1+成纤维细胞富集氧化还原酶活性，负调控FMT基因升高，但单细胞转录组分析为观察性，不能证明因果。神经酰胺酶可生成S1P，S1P参与肌成纤维细胞活化和纤维化；缺氧增加SPNS2，D-Nmappd降低SPNS2，这些发现与神经酰胺酶活性可能维持较少活化表型并可能促进S1P合成/外排的可能性一致。局限包括药理学抑制需遗传方法补充、转录组关联非因果、通路富集基于fold change选择代谢物属探索性、需肺纤维化模型和人纤维化组织验证。尽管如此，代谢、氧化还原、表型和人类转录组观察汇聚，将酸性神经酰胺酶依赖性鞘脂代谢与成纤维细胞缺氧应激适应联系起来，并确定ASAH1为缺氧纤维化肺中成纤维细胞代谢适应和表型重塑的候选调节因子。
研究结论翻译：总之，该研究提供药理学证据表明，扰动酸性神经酰胺酶与缺氧成纤维细胞的代谢、氧化还原和表型变化相关，并得到IPF肺bulk和单细胞转录组分析的关联证据补充。因细胞组成差异和潜在临床异质性，全肺转录组相关性应谨慎解释，而单细胞分析提供额外证据，将ASAH1表达与IPF成纤维细胞内特定转录程序联系起来。综上，这些发现确定ASAH1是成纤维细胞对缺氧应激适应的候选调节因子，并为未来使用遗传和生化方法开展机制研究提供依据。
