基于16S rRNA cDNA测序解析牛肉屠宰过程中核糖体活跃微生物群落及其卫生指示意义

《Frontiers in Microbiology》：RNA-based characterization of ribosomally active microbial communities during beef slaughtering

引言：牛肉胴体上的微生物污染会缩短货架期并带来显著食品安全风险。如今，基于RNA的分析通过靶向核糖体RNA（rRNA）而非脱氧核糖核酸（DNA），使研究人员能够洞察微生物群落中潜在活跃的部分。方法：在此，研究人员在奥地利一家屠宰场，采用16S rRNA cDNA（互补DNA）测序（Illumina MiSeq），对牛屠宰三个关键阶段——剥皮、劈半和冷却——存在的rRNA衍生微生物群进行了分析。结果：尽管三个加工位点的微生物α多样性（alpha diversity）相似，但PERMANOVA（permutational multivariate analysis of variance）揭示加工步骤对微生物群落组成具有统计学显著影响。剥皮和冷却阶段的胴体含有高相对丰度的rRNA衍生Pseudomonas和Escherichia-Shigella群。Pseudomonas spp.为嗜冷性腐败相关属，其高相对丰度提示潜在代谢活性及在低温下可能促进质量劣变；而Escherichia-Shigella群常用作潜在粪便污染和卫生缺陷的指示。Eperythrozoon (Mycoplasma)在劈半阶段丰度更高，在冷却阶段较低，提示部分牛可能进入屠宰时已被定植，并在胴体操作过程中促进交叉污染。其在冷却期间的后续下降与Eperythrozoon (Mycoplasma)对冷敏感及有限的环境持久性一致。讨论：这些发现证明基于RNA的方法在界定胴体相关微生物群活跃部分方面具有价值，并有潜力为增强肉品卫生与安全的干预措施提供信息。

研究背景：牛肉是营养密集食品，可提供蛋白质及铁、锌、硒、omega-3脂肪酸和维生素B₁₂等，但牛肉生产与消费面临环境、健康和伦理挑战。牛肉生产资源密集，并贡献温室气体排放、森林砍伐和生物多样性损失。供应链中的食物损失与浪费部分源于微生物污染，如Pseudomonas spp.、Clostridium spp.、Brochothrix thermosphacta等导致腐败，降低食品质量和货架期，造成经济损失和消费者拒购；同一污染也可导致食源性疾病，如Salmonella spp.和Listeria monocytogenes，动物源食品包括牛肉是暴发的重要来源。因此，改善卫生和微生物控制对减少浪费与风险、评估牛肉生产可持续性及其营养益处至关重要。传统培养法可分离纯菌株、进行表型表征并作为抗菌药敏试验金标准，但大量微生物处于“可行但不可培养”（viable but non-culturable, VBNC）状态，无法在标准实验室条件下生长，导致微生物多样性代表性不全。非培养核酸测序技术，尤其下一代测序（next-generation sequencing, NGS），可高通量、详细地表征微生物群落。16S rRNA基因扩增子测序利用保守区和分类信息丰富的超变区，是属水平评估细菌群落组成最有效的方法之一。然而，DNA法不能区分活细胞、死细胞和残留DNA；rRNA法靶向核糖体RNA，可提供微生物群落潜在活跃部分的信息。检测rRNA衍生微生物群对食品安全评估可能至关重要，因为潜在代谢活跃细菌负责腐败和疾病。表征牛肉胴体rRNA衍生微生物群可改善卫生实践、识别污染源、评估去污策略；通过减少微生物传播和腐败，可提升产品质量，支持靶向干预，并最终改善公共健康结局。

研究设计与关键技术方法：研究人员在奥地利一家IFS-Food（International Featured Standards）认证屠宰场单日采样，胴体来自不同屠宰批次和不同农户。采样阶段为剥皮（n=9）、劈半（n=10）和冷却（>24 h，n=9）；冷却胴体来自前一个屠宰日。用无菌一次性手术刀在上臀部刮取10 cm²表面，立即置RNAlater并于?80°C保存。提取RNA，去除残留DNA，PCR检测残留DNA，RNA完整性数（RNA integrity number, RIN）≥7后合成cDNA。靶向16S rRNA V3–V4区扩增，Nextera XT建库，Illumina MiSeq平台2×300 bp双端测序。DADA2在QIIME 2中质控、去噪和去嵌合，SILVA 138.2分类；R中进行统计，包括iNEXT、PERMANOVA和DESeq2等。

研究结果：
3.1 总体测序特征与门属水平组成：研究人员获得555,914条高质量reads，解析5,540个ASV（amplicon sequence variant），归属33门、301科和687属。剥皮阶段以Pseudomonadota为主，中位相对丰度59.8%，四分位距（interquartile range, IQR）17.9–76.5%；随后为Bacillota（中位14.0%，IQR 6.9–17.9%）、Actinomycetota（8.0%，IQR 3.6–20.0%）和Bacteroidota（6.0%，IQR 4.5–10.6%）。属水平上，Pseudomonas中位5.1%，prevalence 89%；Escherichia–Shigella中位16.1%，prevalence 100%；Oscillospiraceae UCG-005中位4.9%，prevalence 78%；Corynebacterium中位3.2%，prevalence约100%。
3.2 剥皮阶段：群落主要由Pseudomonadota、Bacillota、Actinomycetota和Bacteroidota构成，Pseudomonas和Escherichia–Shigella为主要Pseudomonadota类群。
3.3 劈半阶段：群落明显转向Bacillota，中位36.9%，IQR 29.8–43.3%；Pseudomonadota中位31.6%，Bacteroidota中位8.6%，Actinomycetota中位6.2%。最丰富属包括Eperythrozoon (Mycoplasma)中位10%，IQR 0.5–20.2%；Gulbenkiania中位11.1%，IQR 8.1–16.1%；Corynebacterium中位3.8%，IQR 1.8–6.9%；Exiguobacterium中位2.2%，IQR 1.3–2.9%，四者prevalence均为100%。Mycoplasma (Eperythrozoon)和Corynebacterium在剥皮后样本中分别89%和100%存在，而Gulbenkiania和Exiguobacterium在剥皮样本未检出。
3.4 冷却阶段：Pseudomonadota再次占优势，中位61.4%，IQR 28.7–80.0%；Bacillota中位28.5%，IQR 11.2–32.7%；Bacteroidota中位5.5%，IQR 1.1–7.3%。属水平上Escherichia-Shigella最丰富，中位11.6%，IQR 5.3–41.7%；Pseudomonas中位2.4%，IQR 2.1–8.1%；其他属中位相对丰度均低于2%。
3.5 Alpha多样性：Hill-Shannon和Hill-Simpson指数显示各加工阶段多样性变化不大，Kruskal-Wallis检验未检测到统计学显著差异（p>0.05）。
3.6 Beta多样性与群落分异：基于Bray-Curtis（BC）的主坐标分析显示样本按加工位置部分分离；剥皮和冷却样本大量重叠，劈半样本占据较受限区域，表明其相似性更高。Jaccard和Jensen-Shannon距离呈相似模式。BC下多元离散无显著差异（ANOVA，F=0.51，p=0.607）。PERMANOVA显示加工位置显著解释群落组成变异（F=2.25，p=0.001），但效应量中等偏小，R²=0.163。
3.7 差异丰度分析：DESeq2显示劈半阶段Gulbenkiania、Exiguobacterium、Tepidiphilus显著富集；Halomonas和Sphingomonas在剥皮阶段显著更高，劈半后下降。

讨论：RNA法靶向rRNA转录本，因此反映胴体微生物组中潜在代谢活跃部分，排除死细胞和胞外DNA。其重要局限在于，rRNA检测不能作为持续代谢活动的绝对证据；rRNA可在近期死亡或代谢不活跃细胞中持续，且细胞rRNA丰度受分类群生理、生长状态和环境条件影响，不一定直接对应代谢活动。因此，本研究表征的rRNA衍生群落应解释为潜在活跃或核糖体活跃部分，而非完全活且代谢活跃细胞；确认活性或活力需培养、活力测定或功能RNA分析。既往DNA和培养研究常报道Pseudomonas、Acinetobacter、Psychrobacter、Clostridium sensu stricto和未分类Enterobacteriaceae；本RNA群落谱一致发现Pseudomonas和Escherichia-Shigella在全部加工阶段占优势。许多后期在牛排和牛肉产品上检测到的腐败菌，包括Pseudomonas spp.和Enterobacterales成员，在加工早期已存在。Pseudomonas spp.在冷却阶段检测尤为关键，因其嗜冷，可在真空或气调条件下持续，提示腐败风险和卫生缺口。按Regulation (EC) No 2073/2005，Enterobacteriaceae基于定量培养法用作牛胴体过程卫生指标；本研究中Enterobacteriaceae在96.4%胴体检出，半数样本相对丰度超过10%，但不能直接与法规阈值比较。皮肤相关Staphylococcus和Corynebacterium在剥皮阶段prevalence分别为88.9%和100%；Staphylococcus中位相对丰度0.4%，个别样本达14%，后期中位为0.0%。E. coli全程可检出。Corynebacterium中位相对丰度在剥皮为3.2%，劈半为3.8%，冷却为1.8%。Halomonas和Sphingomonas在剥皮后显著高于其他时间点，研究人员推测其来源于动物皮、粪便、水、土壤和加工环境；劈半后下降可能源于胴体清洗、修剪及设备表面暴露。瘤胃相关Ruminobacter、Fibrobacter和Christensenellaceae中位相对丰度在所有阶段均低于1%，其低prevalence与瘤胃向胴体表面转移有限及严格瘤胃厌氧菌在肠道外存活差一致。劈半后Gulbenkiania、Exiguobacterium和Tepidiphilus高相对丰度突然出现；Nakamura等发现胴体清洗器中有高量Gulbenkiania，研究人员推测剥皮与劈半之间的胴体清洗或冲洗步骤可能引入这些属。这些菌与生产线和环境相关，但尚无其腐败或致病潜力报道。Desulfobulbus在剥皮和冷却缺失，劈半时低丰度检出（中位0.6%，IQR 0.1–1.4%）；其为厌氧硫酸盐还原菌，常见于缺氧水生沉积物和废水生物膜，屠宰场洗水和肉加工厌氧消化器已有记录，劈半检出可能反映加工中水暴露污染。Eperythrozoon (Mycoplasma)序列丰度较高，BLAST分析显示与Mycoplasma haematobovis 100%核苷酸一致。该嗜血种粘附红细胞表面，通常引起牛亚临床或轻度感染；慢性感染可致贫血、发热、淋巴结病、食欲减退和抑郁。其检测很可能反映屠宰时存在感染动物；劈半中位10%高于剥皮0.1%和冷却1.5%，可能因感染动物随机分布而非阶段选择。M. haematobovis并非食品安全主要关注点，但该辅助发现将胴体微生物群与牛群感染状态联系，并说明屠宰场测序可作为检测牛群亚临床感染的工具。局限性包括：单日采样但各工位采样不同胴体，因此观察应解释为加工位置差异而非单个胴体内时间演替；冷却胴体来自前一个屠宰日并经历>24 h冷却，差异可能混合冷却条件、加工日效应、胴体间变异和设施微生物库，设计无法拆分这些因素。冷却环境明显不同但缺乏显著群落分离，提示短期暴露可能不足以驱动活跃群落重大重构；加工相关差异更可能影响早期已存在菌的相对活动和优势，而非引入不同微生物组合。不同胴体采样使胴体间变异和设施微生物库可能显著影响beta多样性。PCR阴性对照和试剂阴性对照无扩增，但阴性对照未测序，低于PCR检测阈的试剂或实验室来源污染无法通过生物信息学评估。加工位置效应显著但效应量小，R²=0.163，说明加工阶段仅解释总体群落变异的一小部分，与排序图中大量重叠一致；因此不应解释为微生物群落强烈重构，而是潜在活跃微生物群相对组成的阶段相关变化。总体上，活跃微生物群落反映皮源、粪便和环境输入，早期引入菌尽管存在卫生屏障仍持续贯穿加工。结果提示：剥皮需严格控制皮源污染，劈半后阶段易受水和设备引入影响，冷却需优化以限制耐冷腐败菌；针对这些点可最有效减少污染并改善牛胴体卫生。

结论翻译：本研究证明，基于RNA的测序为牛肉加工过程中潜在代谢活跃微生物提供了更清晰视图。关键类群在不同工位的不同模式突出加工步骤和局部环境条件的影响。Pseudomonas和Escherichia–Shigella在剥皮和冷却工位持续检测到，而在劈半工位丰度较低，反映阶段相关变异而非单个胴体内时间变化，因为每个加工阶段胴体不同。Eperythrozoon (Mycoplasma)序列的偶然检测进一步说明该方法可提供更广泛生物学洞察。劈半阶段后Gulbenkiania、Exiguobacterium和Tepidiphilus突然出现，强调加工过程中微生物输入的动态性和胴体依赖性。本研究结果应结合局限性解释，包括相对较小样本量、单日采样设计、未评估可能促进胴体加工中微生物变化的湿度与温度等环境因素。此外，每个加工阶段采样不同胴体，无法纵向评估单个胴体内微生物演替。因此，观察到的差异可能部分反映胴体间变异和设施特异条件。需要更大规模、纵向和多设施研究，以确定此处观察到的活动模式是否代表牛肉加工微生物组的更广泛特征。