自体造血干细胞移植降低多发性硬化患者脑内炎症及轴突胶质损伤生物标志物水平

《Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation》：Autologous Hematopoietic Transplantation Reduces Brain Inflammatory and Axoglial Damage Biomarkers in Multiple Sclerosis

　　

： 背景与目的：自体造血干细胞移植（autologous hematopoietic stem cell transplantation，AHSCT）可诱导重症多发性硬化（multiple sclerosis，MS）患者产生长期免疫耐受并使疾病处于静止状态，但其潜在机制尚不明确。研究人员假设AHSCT可诱导血清和脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中炎症性细胞因子、趋化因子及轴突胶质损伤生物标志物持续下降。 方法：研究人员从HALT-MS试验（NCT00288626）中24例接受AHSCT的重症MS受试者处获取纵向血清和CSF样本，其中血清在预处理前至移植后第60个月共9个时间点采集，CSF在预处理前、第24个月和第48个月共3个时间点采集。研究人员分析了约50种可溶性生物标志物，以确定治疗诱导的变化及其与疾病活动度（包括临床和MRI参数）的关联。 结果：AHSCT导致血清和CSF中多种促炎细胞因子、趋化因子及神经炎症标志物（包括神经丝轻链（neurofilament light chain，NfL））表达持续数年下降。相反，CSF中胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acid protein，GFAP）和IL-7水平在治疗后升高。AHSCT后早期巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）和/或EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）扩增导致血清炎症细胞因子一过性升高，但这些变化未持续存在。血清中的变化与CSF中的变化大体不同，血清中细胞因子和趋化因子浓度与CSF中浓度很少相关，NfL除外。 讨论：这些结果证实了研究人员的假设，即AHSCT可长期降低炎症细胞因子、趋化因子及轴突胶质损伤标志物，与持续的疾病静止状态一致。血清和CSF生物标志物之间缺乏关联提示这些样本在很大程度上反映不同的免疫过程和区室，尽管腰椎穿刺存在挑战，但分析CSF可能有助于更深入理解中枢神经系统（central nervous system，CNS）中的疾病过程。CSF中IL-7的表达可能是CNS炎症状态中一个被低估的生物标志物，值得进一步研究。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种以中枢神经系统（central nervous system，CNS）炎性脱髓鞘和轴突损伤为特征的慢性自身免疫性疾病。自体造血干细胞移植（autologous hematopoietic stem cell transplantation，AHSCT）已在重症复发缓解型MS（relapsing-remitting MS，RRMS）患者中显示出诱导长期免疫耐受和疾病静止的能力，但其潜在的免疫学机制尚未完全阐明。神经丝轻链（neurofilament light chain，NfL）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acid protein，GFAP）分别是轴突退变和胶质细胞损伤的副产物，反映神经元损伤中两个不同的病理过程，并与MS疾病活动度相关或可预测疾病活动度。既往研究已显示AHSCT后NfL下降，而GFAP保持不变。然而，关于AHSCT对血清和CSF中大量炎症细胞因子、趋化因子及神经轴突胶质损伤生物标志物的同步影响，以及这些变化与临床结局的关系，目前知之甚少。此外，AHSCT后早期巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）和EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）血症较为常见，但其对血清和CSF生物标志物的影响此前尚未被系统研究。基于此，研究人员在HALT-MS试验队列中开展了本研究。

二、研究设计与主要发现

研究人员假设AHSCT诱导的MS活动度降低与促炎细胞因子下降和调节性介质增加相关，同时NfL和GFAP降低反映神经胶质损伤减轻。为验证这些假设，研究人员在HALT-MS试验（NCT00288626）的24例重症RRMS受试者中，对移植前后血清和CSF中约50种细胞因子、趋化因子及神经炎症和神经退行性变生物标志物进行了纵向分析。血清在移植前基线及移植后1、2、6、12、24、36、48、60个月共9个时间点采集，CSF在移植前及移植后第24、48个月共3个时间点采集。研究还纳入了6例非MS非炎症性对照的CSF样本用于比较。

研究结果显示，AHSCT导致血清和CSF中多种促炎细胞因子、趋化因子和神经炎症标志物表达持续数年下降。CSF中NfL在移植后第24个月和第48个月均显著下降，与疾病活动度受抑制一致。CSF中免疫球蛋白G（IgG）浓度、IgM浓度及IgG指数在第24个月显著下降，6例基线IgM寡克隆区带（oligoclonal bands，OCB）阳性者中有3例在第48个月转为阴性，提示AHSCT可能对CNS中浆细胞的发育或维持产生长期影响。与NIND对照比较，IFNγ、IL-12/23p40和IL-10在AHSCT后降至与对照相当的水平，提示炎症细胞因子趋于"正常化"。CSF中仅IL-7和GFAP在第24个月显著升高，且二者在第48个月不再升高。血清中NfL在移植后第1、2个月短暂升高，随后从第24个月起显著低于基线并持续至第60个月。血清中持续降低的生物标志物包括TNFα、IL-4、CCL4、NfL、BDNF、NPTX1和aMMP9，持续升高的包括IL-7、IL-2、GM-CSF、TNFβ、CCL17和NfH。血清与CSF中仅有两项变化一致，即NfL下降和IL-7升高。

三、关键技术方法

研究人员采用了以下主要技术方法：第一，基于HALT-MS试验（NCT00288626）的前瞻性、开放标签、单臂、多中心II期临床试验队列，纳入24例重症RRMS受试者，接受BEAM方案（卡莫司汀、依托泊苷、阿糖胞苷、美法仑）联合兔抗胸腺细胞球蛋白预处理和CD34分选细胞回输；第二，采用Meso Scale Diagnostics（MSD）的V-PLEX和S-PLEX高灵敏度免疫分析平台检测血清和CSF中约50种可溶性生物标志物；第三，采用DuoSet ELISA检测可溶性CD27（sCD27），定制MSD板检测CCL19、CXCL10和CXCL13；第四，采用散射免疫比浊法在BN ProSpec分析仪上定量血清和CSF白蛋白、IgG和IgM，采用等电聚焦和免疫印迹法检测寡克隆IgG和IgM条带；第五，通过pp65抗原血症或DNA检测法监测CMV病毒载量，通过PCR每周监测EBV病毒载量；第六，采用配对t检验分析CSF变化，采用线性混合效应模型分析血清变化及与EBV或CMV的关系，采用重复测量相关分析评估个体内细胞因子关联，采用线性回归评估临床指标与细胞因子的关联，所有统计分析在R 4.4.2中完成。

四、研究结果

AHSCT导致CSF和血清中疾病相关细胞因子、趋化因子和神经炎症标志物表达下降：通过比较移植前与移植后第24、48个月的CSF样本，发现第24个月时有11种介质显著下降、2种显著升高。下调的介质包括IFNγ、IL-12/23p40、IL-12p70、IgM、IgG及IgG指数、IL-10、sICAM1、CCL22和CCL19等。NfL在移植后第24个月和第48个月均显著下降。IL-7和GFAP是仅有的两种在第24个月升高的因子，且在第48个月不再升高。NfL是唯一在第48个月仍显著不同于基线的生物标志物。与NIND对照比较，IFNγ、IL-12/23p40和IL-10降至对照水平，IL-7升高水平与对照一致。

血清和CSF细胞因子浓度之间的强相关性罕见：研究人员评估了基线、第24个月和第48个月时血清与CSF之间的相关性。血清NfL与CSF NfL之间存在强相关性（r=0.86，p=2×10??），确认血清是CSF的可靠替代指标。血清GFAP与CSF GFAP在基线时显著相关（r=0.70，p=1.2×10??），但纳入全部三个时间点时不再相关（r=0.18，p=0.386）。在血清和CSF中均可检出的12种细胞因子中，仅IL-12/23p40（r=0.48，p=0.01）和TNFα（r=0.41，p=0.035）具有统计学显著但较弱的相关性。IgM在血清和CSF间显著相关（r=0.64，p=4.8×10??），而IgG不相关（r=0.26，p=0.22）。对照分析显示血清淀粉样蛋白A（r=0.84，p=7×10??）和C反应蛋白（r=0.56，p=0.003）在血清和CSF间存在强相关性，证明两个区室间的强相关性是可行的。大多数细胞因子缺乏相关性提示血清和CSF反映不同的免疫生态位。

CSF中多种炎症介质协同调控且独立于NfL：在基线时，CSF中NfL、NfH、IgM指数和IgG指数之间存在强正相关。然而，CSF中NfL与任何细胞因子/趋化因子之间均无强正相关。CSF IL-7与NfL呈负相关。CSF GFAP水平与其他生物标志物基本独立。IFNγ、IL-12/23p40、TNFα、GM-CSF、IL-2、IL-10、ICAM1、CCL17、CCL19和CCL22之间存在强正相关，提示存在协同调控的炎症网络。IL-10与IgG指数强正相关，提示IL-10可能通过促进鞘内B细胞发挥炎症作用。CSF IL-7与包括IgG指数、IL-12/23p40、IL-10、ICAM1和CCL22在内的多种炎症介质呈负相关。血清中炎症介质之间的相关性远弱于CSF。

AHSCT后早期CMV和EBV血症改变血清细胞因子环境：24例受试者中，10例出现可检出的CMV血症，12例出现可检出的EBV血症，其中5例两者兼有。CMV血症与移植后1个月血清中IFNγ、IL-12p70、CXCL10、IL-2和TNFα等炎症介质升高相关。EBV血症与移植后1个月GM-CSF、IL-10和TNFα显著升高及CCL17、CCL22和BDNF显著降低相关。病毒相关细胞因子变化在移植后1个月最显著，后续时间点差异较少。CMV或EBV血症与CSF生物标志物浓度之间无显著关联。

基线时NfL和GFAP是与临床参数关联最强的生物标志物：在基线时，CSF NfL与T1和T2病灶体积及EDSS评分正相关。CSF GFAP与T1和T2体积正相关，与MSFC评分负相关。IgG指数和CSF IL-10与既往18个月复发次数正相关。CSF IL-12/23p40、CCL17和CCL22与钆增强（Gd+）病灶数量正相关。CSF ICAM1与MSFC评分负相关。血清中NfL与T1体积、T2体积、EDSS评分正相关并与MSFC评分负相关，GFAP与T2体积和EDSS评分正相关。血清TNFβ与Gd+病灶数量正相关，血清CCL4与T1和T2病灶体积正相关。仅NfL、NfH和GFAP在血清和CSF中均与疾病活动度正相关。

生物标志物浓度变化与临床变量变化的关系：AHSCT后EDSS评分在第1至第4年显著下降。CSF中NfH下降与Gd+病灶数量减少和MSFC评分改善相关。IgM指数下降与T1病灶体积增加相关。CSF中IL-12/23p40、ICAM1和CCL17下降与Gd+病灶数量减少相关。血清中NfL、TNFα和CCL4浓度下降与MRI参数改善相关，包括Gd+病灶数量减少、T2病灶体积减小和/或T1病灶体积增加。血清IL-7、IL-10、TNFβ和BDNF升高与EDSS降低或MSFC评分改善相关。在7例达到主要终点（新疾病活动度）的受试者中，新疾病活动度与较高的预处理血清IL-6、sNPTX1、CSF TNFα和CSF IL-2水平及较低的预处理血清IL-7水平相关。

五、讨论与结论

研究讨论指出，AHSCT诱导的长期免疫耐受与"免疫重置"概念一致，即清除大部分预先存在的T细胞受体克隆并伴随T细胞表型改变。AHSCT后CSF中IFNγ和IL-12/23p40显著下调，提示Th1轴在MS病理生理中发挥作用。鞘内B细胞活化与MS相关，AHSCT后CSF IgG浓度和IgG指数下降、IgM OCB在3/6受试者中消失，提示AHSCT可清除CNS中部分克隆扩增的抗体产生细胞。CSF中IL-10和CCL19下降提示鞘内B细胞募集减少和/或生长存活下降。GFAP升高可能反映反应性星形胶质增生或随年龄增长的自然趋势。IL-7升高可能反映淋巴细胞耗竭后的稳态反应或T细胞浸润减少导致的消耗降低，与其他研究中那他珠单抗、IFNβ和甲泼尼龙治疗后CSF IL-7升高的发现一致。血清与CSF变化重叠少、相关性弱，提示两个区室的炎症环境可能相对独立，CNS驻留的小胶质细胞、巨噬细胞和星形胶质细胞可能是部分受AHSCT影响的细胞因子的重要来源。CMV和EBV再激活均可增加早期免疫重建期间的炎症环境。研究的主要局限是样本量小，但具有纵向随访5年、多时间点CSF样本、丰富的临床和MRI数据以及血清和CSF中多种生物标志物分析等优势。

研究结论为：AHSCT可导致炎症细胞因子、趋化因子和轴突胶质损伤因子发生长期变化，且CNS与外周循环中的变化存在显著差异。这些发现支持AHSCT通过消除促炎细胞亚群并增强调节通路，实现净抗炎和耐受原性改变的模型。