非再灌注缺血性卒中自然免疫过程中经典与中间单核细胞亚群及其衍生比值（LMRclas与LMRint）的探索性研究

《Frontiers in Neuroscience》：Classical and intermediate monocytes and their ratios in the natural immune course of ischemic stroke

　　

引言：单核细胞参与缺血性卒中（ischemic stroke, IS）的免疫反应，并参与急性炎症和缺血后修复。然而，经典单核细胞（classical monocytes, cMo）、中间单核细胞（intermediate monocytes, intMo）和非经典单核细胞（non-classical monocytes, ncMo）功能不同，且诸如淋巴细胞与单核细胞比值（lymphocyte-to-monocyte ratio, LMR）等复合指标不能区分它们。研究人员在未接受再灌注治疗的急性IS患者中，表征了单核细胞亚群及两种亚群衍生比值，即淋巴细胞与经典单核细胞比值（lymphocyte-to-classical monocyte ratio, LMR_clas）和淋巴细胞与中间单核细胞比值（lymphocyte-to-intermediate monocyte ratio, LMR_int）的动态，从而评估自然免疫反应。方法：研究人员前瞻性研究了31例患者和16例对照，在患者入院时、24 h和48 h获取全血细胞计数和/或流式细胞术结果，并将这些发现与美国国立卫生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale, NIHSS）、90天内的改良Rankin量表（modified Rankin Scale, mRS）以及卒中相关性感染（stroke-associated infection, SAI）的发生相关联。相关性使用Spearman秩相关系数评估，并在四个预设家族内应用Benjamini-Hochberg校正。结果：与对照相比，患者在入院时、24 h和48 h淋巴细胞计数降低，而总单核细胞计数在任何时间点均无差异。在单核细胞区室内，intMo计数在24 h和48 h增加，LMR_int在48 h降低，而cMo和ncMo计数保持不变。48 h较低的LMR与更大的卒中严重程度和较差的功能结局相关；48 h较高的cMo计数和24 h较低的LMR_clas与90天较差结局相关；入院时较低的LMR_clas与SAI发生相关。经多重比较校正后，这些关联均未保持显著性，且调整年龄、性别和基线NIHSS后，两种比值均未与90天结局独立相关。讨论：综上，这些探索性发现提示，尽管总单核细胞计数未变，缺血性卒中后单核细胞区室发生重组；这种转变复合指标无法捕捉，但LMR_clas和LMR_int可能反映。此处报告的估计值可作为在更大、具有足够效能队列中评估这些比值的基础。

缺血性卒中（ischemic stroke, IS）是欧洲成人第二位死亡原因和首位致残原因。再灌注治疗虽已进展，但即使资源充足地区仍仅覆盖少数IS患者，且不足50%患者达到功能独立。小卒中（minor ischemic stroke, MIS；NIHSS < 5）中机械取栓相对最佳药物治疗的获益尚未确立，观察数据显示两者90天功能结局相似，且取栓与更高的症状性颅内出血相关。相当比例真实世界IS患者，尤其是老年人、无大血管闭塞或超出治疗时间窗者，未接受再灌注治疗。早期诊断和及时治疗对降低残疾和死亡至关重要，但症状轻微或不典型可导致误诊和临床决策延迟。因此，亟需识别可支持临床评估、改善危险分层和指导决策的血液候选指标。单核细胞参与IS病理生理反应，包括急性炎症反应和后续组织修复。人单核细胞按CD14和CD16表达分为经典单核细胞（classical monocytes, cMo；CD14⁺⁺CD16^-）、中间单核细胞（intermediate monocytes, intMo；CD14⁺⁺CD16⁺）和非经典单核细胞（non-classical monocytes, ncMo；CD14⁺CD16⁺⁺），其功能不同。既往IS临床研究多依赖总单核细胞计数或由其衍生的淋巴细胞与单核细胞比值（lymphocyte-to-monocyte ratio, LMR），将单核细胞区室视为功能同质，不能捕捉各亚群独特生物学信号。LMR在脑血管病中具预后价值，但其区分能力有限，且尚无研究检验亚型特异性比值，即淋巴细胞与经典单核细胞比值（lymphocyte-to-classical monocyte ratio, LMR_clas）和淋巴细胞与中间单核细胞比值（lymphocyte-to-intermediate monocyte ratio, LMR_int），是否在IS中提供额外诊断或预后价值。研究人员因此旨在探索非再灌注IS自然病程中外周血单核细胞亚群及其衍生比值。

研究人员开展前瞻性观察性重复测量临床研究，纳入31例未接受再灌注治疗的急性IS患者和16例健康志愿者，在入院、24 h和48 h获取全血细胞计数和/或流式细胞术（flow cytometry, FC）数据，并与美国国立卫生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale, NIHSS）、改良Rankin量表（modified Rankin Scale, mRS）至90天及卒中相关性感染（stroke-associated infection, SAI）相关联。结果显示，非再灌注IS自然病程中淋巴细胞减少而总单核细胞未变；intMo在24 h和48 h选择性增加，LMR_int在48 h下降；LMR_clas与90天功能结局和SAI存在未校正关联，但经Benjamini-Hochberg错误发现率（false discovery rate, FDR）校正后无关联，调整年龄、性别和基线NIHSS后比值不独立。该研究首次表征LMR_clas和LMR_int在人类非再灌注IS自然病程中的动态，提供效应估计，为更大样本验证奠定基础。

方法概括：前瞻性、观察性、重复测量临床研究，遵循GCP和《赫尔辛基宣言》。2019年3月至2024年1月从西班牙马德里Hospital Universitario Fundación Jiménez Díaz和Hospital Universitario 12 de Octubre卒中单元招募31例患者和16例健康志愿者。患者为≥18岁、病前mRS≤2、发病24 h内IS且未接受纤溶或取栓。入院、24 h、48 h行全血细胞计数和/或FC；记录NIHSS、mRS至90天及SAI。采用Mann-Whitney U、Kruskal-Wallis、Spearman秩相关，Benjamini-Hochberg FDR在四个预设家族内校正，并行有序logistic回归、线性回归和受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线分析。

结果：

临床数据：31例患者中位年龄77岁，19%为女性，81%为男性；高血压最常见；动脉粥样硬化性病因38.7%，心源性32.3%，腔隙性9.7%，不明19.4%。4例住院期间发生感染，1例随访期复发。对照中位年龄52.5岁，5例女性、11例男性。3个月时71.0%患者达到功能独立（mRS≤2），9例（29.0%）预后差（mRS≥3），2例（6.5%）死亡。

非再灌注缺血性卒中自然病程中淋巴细胞而非总单核细胞计数的急性变化：通过全血细胞计数比较，与对照相比，患者入院、24 h、48 h淋巴细胞计数显著降低；总单核细胞计数在各时间点与对照无显著差异，且随时间无显著变化。

非再灌注缺血性卒中自然病程中LMR及其与卒中严重程度和结局的关联：LMR在入院和24 h显著低于对照，48 h无差异；48 h LMR与48 h NIHSS及24 h、48 h、90天mRS呈负相关。通过Spearman相关分析得出，48 h较低LMR与更大卒中严重程度和较差功能结局相关。

非再灌注缺血性卒中中间单核细胞和LMR_int动态：通过FC显示，intMo计数在24 h和48 h高于对照，且随时间总体差异显著，24 h和48 h高于入院；cMo和ncMo计数无显著变化。LMR_int在48 h低于对照，并随时间进行性下降。未发现intMo计数与各时间点NIHSS或mRS显著关联。

非再灌注缺血性卒中经典单核细胞和LMR_clas与临床结局的关联：48 h cMo计数与90天NIHSS正相关；24 h LMR_clas与90天NIHSS和mRS负相关；入院时较低LMR_clas与住院期间SAI风险升高相关。这些关联来自FC亚组和logistic回归，事件数很少。经FDR校正后均未保持显著性；调整年龄、性别和基线NIHSS后，LMR_clas和LMR_int均未与90天结局独立相关，而基线NIHSS仍显著相关。

ROC曲线分析：诊断区分IS与对照时，总LMR的曲线下面积（area under the curve, AUC）为0.78，LMR_clas为0.77，LMR_int为0.65；预后区分90天mRS≥3时，总LMR的AUC为0.60，LMR_clas为0.75，LMR_int为0.52。因样本量小和事件数少，这些估计被报告为描述性和探索性。

讨论部分总结：研究人员认为，这些探索性发现提示非再灌注IS后单核细胞区室发生重组，尽管总单核细胞计数不变；复合指标无法捕捉该变化，而LMR_clas和LMR_int可能反映。急性淋巴细胞减少与既往将卒中诱导免疫抑制联系起来的报道一致。与Urra et al.混合缺血和出血性卒中队列、Kaito et al.以其他神经疾病为对照不同，本研究限于IS，排除再灌注、并发炎症、感染和肿瘤，对照组无急性神经疾病，但年龄未匹配。67.7%患者为MIS，其自然单核细胞反应较少被描述。研究人员提出亚型比值作为探索方向，而非既定指标。LMR与严重程度和功能结局的关联与既往研究一致。intMo选择性增加并伴LMR_int下降，提示其可能参与脑缺血后急性免疫反应；但intMo和LMR_int与NIHSS或mRS无显著关联。cMo和LMR_clas关联来自小FC亚组，效应方向值得检验，但大小不宜按面值解读。cMo扩张可能反映骨髓释放和向脑募集，但机制不能由本研究确定。LMR_clas与SAI关联基于极少数感染事件，应视为假设生成。局限包括样本量小、FC后两个时间点例数少、对照年龄不匹配；多重比较校正后无关联，调整后无独立贡献；ROC区分能力有限，切点未外部验证；年龄差异可能影响病例对照比较，尤其是LMR，但纵向分析不涉及对照组，故不受该年龄差异影响。优势包括严格入组、观察自然病程、固定采血时间以减少昼夜变异。

结论翻译：本探索性研究据研究人员所知首次表征单核细胞亚群比值LMR_clas和LMR_int及其在人类非再灌注IS自然病程中的动态。主要发现是急性期循环intMo选择性增加、LMR_int进行性下降、24 h LMR_clas与90天功能结局以及入院LMR_clas与住院期间SAI发生的关联。这些关联在未校正分析中观察到，经多重比较校正后未保持统计学显著性；在调整年龄、性别和基线NIHSS的模型中，两种比值均未与90天结局独立相关，而基线IS严重程度仍相关。因此，目前结果为假设生成性，提示单核细胞亚群动态及其衍生比值可能反映与IS临床病程相关的免疫反应方面，值得进一步研究LMR_clas和LMR_int作为患者特征候选参数。需要在更大、独立、前瞻性、具有足够效能并纳入接受再灌注治疗患者的队列中验证。未来工作应结合亚群定量与单核细胞功能标志，并将采样延长至48 h以后，以捕捉修复性单核细胞功能占优势的亚急性期。