《Frontiers in Immunology》：TXN/TXNIP signatures point to plasma cells as a potential immune hub in periodontitis based on integrated transcriptomic analysis and preliminary experimental validation
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背景： 牙周炎（periodontitis, PD）是一种以牙周组织破坏和牙槽骨丧失为特征的常见慢性炎症性疾病。细胞衰老和昼夜节律相关基因对PD进展的贡献尚未完全明确，限制了生物标志物发现和精准治疗开发。
方法： 研究人员整合了公开可用的PD b
摘要专业翻译
背景： 牙周炎（periodontitis, PD）是一种以牙周组织破坏和牙槽骨丧失为特征的常见慢性炎症性疾病。细胞衰老和昼夜节律相关基因对PD进展的贡献尚未完全明确，限制了生物标志物发现和精准治疗开发。
方法： 研究人员整合了公开可用的PD bulk转录组数据、单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq）数据以及细胞衰老和昼夜节律相关基因集。通过差异表达分析（|log2FC| > 0.5，P < 0.05）和机器学习策略鉴定关键基因并建立诊断模型。随后进行了功能富集、免疫浸润、细胞-细胞通讯、拟时序轨迹和药物预测分析，以表征这些基因的生物学作用和细胞特异性。通过动物实验，利用组织学和免疫荧光分析验证关键基因在牙周组织中的表达和细胞定位（伦理批准号：No. PZW2024031）。
结果： TXN和TXNIP被鉴定为关键基因。基于这些基因的诊断模型在训练集和验证集中均表现出较强的判别能力（曲线下面积（area under the curve, AUC）> 0.7）。通路分析显示，这两个基因均与抗原加工呈递及细胞凋亡相关。TXN与活化B细胞呈负相关，而TXNIP与未成熟B细胞呈正相关。单细胞分析揭示浆细胞（plasma cells）为主要细胞亚群。在PD中，浆细胞从免疫孤立群体转变为交互性调节枢纽，通过MIF信号轴与其他细胞类型广泛通讯，并表现出显著的功能异质性和拟时序依赖性差异。
结论： TXN和TXNIP可作为PD分类的候选分子工具。浆细胞与免疫调节的关联凸显了氧化应激与PD中免疫重塑之间潜在的机制联系，值得进一步研究。
论文解读文章
一、研究背景与问题提出
牙周炎（periodontitis, PD）是由牙菌斑生物膜引起的慢性感染性炎症疾病，以牙龈、牙周膜和牙槽骨等牙周支持组织的进行性破坏为主要特征，严重影响全球数亿人的口腔及全身健康。因此，寻找新型且有效的PD早期治疗靶点对于改善患者长期预后和减轻疾病负担具有重要意义。
细胞衰老是细胞在端粒缩短、DNA损伤、氧化应激和炎症刺激等多种因素诱导下发生的不可逆细胞周期停滞状态。尽管衰老细胞停止分裂，但它们仍保持代谢活性，并通过分泌衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）因子（包括促炎细胞因子、趋化因子、生长因子和基质重塑酶）深刻影响局部微环境。昼夜节律是生物体为适应地球自转产生的约24小时环境周期而进化出的内源性计时机制，由一系列核心时钟基因构成的转录-翻译反馈环路精确调控，广泛影响睡眠-觉醒周期、激素分泌、代谢和免疫等生理过程。近年来，越来越多的证据揭示了细胞衰老与昼夜节律之间的密切相互调节关系：时钟基因的破坏可加速衰老进程，而衰老细胞则表现出明显的昼夜节律紊乱，从而加剧组织功能障碍和慢性炎症。在PD背景下，研究已证实牙周组织内衰老细胞的积累，并证明SASP因子的释放与PD进展和牙槽骨吸收密切相关。然而，细胞衰老和昼夜节律两大系统如何协同作用以及通过何种分子网络参与PD发病机制，仍有待系统阐明。牙周组织持续暴露于微生物、炎症和代谢应激之下，可能扰乱氧化还原和时钟控制的免疫程序，从而在PD中将衰老与昼夜节律紊乱联系起来。
基于上述背景，本研究旨在系统探讨细胞衰老和昼夜节律相关基因在牙周炎发病机制中的作用。研究人员假设这两类基因的协同失调可能通过改变局部免疫微环境而参与牙周炎的起始和进展。为验证这一假设，研究人员分析了公开可用的转录组数据集和单细胞测序数据，以鉴定与细胞衰老和昼夜节律相关的关键分子，并评估其作为牙周炎诊断生物标志物的潜力。研究人员进一步在单细胞水平上表征了与这些基因相关的特定细胞类型，并探讨了疾病相关的细胞间通讯网络改变，旨在为牙周炎的免疫调节机制提供新见解，并为早期诊断和靶向干预鉴定潜在的分子候选物。
二、研究设计与关键方法
研究人员整合了来自GEO数据库的公开数据资源。训练集GSE16134（GPL570平台）包含241例PD患者和69例对照的牙龈组织样本；验证集GSE173078（GPL20301平台）包含12例PD和12例对照样本；单细胞RNA测序数据集GSE164241（GPL18573平台）包含8例PD患者和13例健康对照的牙龈组织单细胞转录组数据。此外，研究人员从已发表文献中获取了276个细胞衰老相关基因（cellular senescence-related genes, CSRGs）和2095个昼夜节律相关基因（circadian rhythm-related genes, CRRGs）。主要关键技术方法包括：单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis, ssGSEA）评估衰老和昼夜节律基因集的整体活性；limma包进行差异表达分析；四种机器学习算法（LASSO回归、XGBoost、Boruta随机森林和支持向量机-递归特征消除（support vector machine-recursive feature elimination, SVM-RFE））进行特征基因筛选；基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析；基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）；免疫浸润分析；药物预测和转录因子及ceRNA调控网络构建；Seurat包进行单细胞数据处理和细胞类型注释；CellChat包进行细胞-细胞通讯分析；monocle包进行拟时序轨迹分析；以及小鼠牙周炎模型的组织学和免疫荧光验证实验。
三、主要研究结果
3.1 牙周炎中细胞衰老和昼夜节律相关候选基因的鉴定
通过ssGSEA分析，研究人员发现PD样本中CSRGs、CRRGs及其交集ACRs（aging and circadian rhythm-related genes, n=75）的富集分数均显著高于对照组，表明这些基因集在PD组织中高度富集。对GSE16134的差异表达分析鉴定出1620个与PD相关的DEGs，其中960个上调、660个下调。将DEGs与ACRs取交集后获得11个候选基因。功能富集分析显示这些基因富集于活性氧响应、氧化应激响应等生物学过程，以及流体剪切应力与动脉粥样硬化、脂质与动脉粥样硬化和IL-17信号通路等KEGG通路。蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络包含8个核心节点，提示这些候选基因可能在PD中作为整合调节模块发挥作用。
3.2 TXN和TXNIP作为关键基因的鉴定与验证
通过四种机器学习算法的交叉筛选，研究人员确定了8个特征基因：AKR1B1、CXCL1、ETS1、FOS、IGFBP3、NFE2L2、TXN和TXNIP。在训练集和验证集中，TXN和TXNIP的表达差异均显著且趋势一致，其AUC值均超过0.7，因此被指定为关键基因。值得注意的是，这两个基因同时属于细胞衰老和昼夜节律基因集，提示它们可能作为整合这两大调节系统的分子介质参与PD。
3.3 基于TXN和TXNIP的列线图构建与验证
研究人员构建了基于TXN和TXNIP的列线图模型以评估PD发生风险。校准曲线显示预测结果与实际观察结果高度一致，决策曲线分析（decision curve analysis, DCA）表明列线图比单基因模型具有更高的临床净获益，组合模型在训练集中的AUC达到0.898。染色体定位分析将TXN定位于9号染色体，TXNIP定位于1号染色体；亚细胞定位预测TXN存在于核质和细胞质中，而TXNIP定位于质膜和细胞质，两者共有的细胞质定位为它们在细胞内信号传导中可能的协同或交互功能提供了空间支持。
3.4 TXN和TXNIP的GSEA和GSVA通路富集分析
GSEA分析揭示了TXN相关的74条富集通路和TXNIP相关的70条富集通路，其中43条为两基因共有。GSVA分析进一步显示，PD中30条通路显著上调，包括B细胞受体信号、Toll样受体信号、趋化因子信号、FcγR介导的吞噬作用、JAK-STAT信号和T细胞受体信号等免疫相关通路。
3.5 免疫浸润特征及其与TXN/TXNIP表达的相关性
免疫浸润分析鉴定出24个在PD和对照组织间富集分数显著差异的免疫细胞亚群。活化B细胞、未成熟B细胞和活化CD4+ T细胞在PD牙龈组织中显著富集，表明适应性免疫活动增强和免疫稳态紊乱。Spearman相关分析显示，TXN表达与包括活化B细胞在内的五种免疫细胞类型呈负相关，而TXNIP表达与大多数这些免疫细胞群呈正相关，提示PD病变中存在活跃的B细胞反应。
3.6 药物预测及转录因子和ceRNA调控网络构建
药物预测显示TXN直接结合藤黄酸（gambogic acid），也是PX-12的已知靶点，而TXNIP仅显示与重组FAS配体的预测结合。转录因子-信使RNA网络预测TXN受一个转录因子（FOXO1）调控，而TXNIP受八个转录因子（包括POLR3A和GATA2）调控。在ceRNA网络中，TXNIP是主要调控靶点，而TXN仅与一个microRNA（miR-5701）关联。这些结果表明TXN可能是更直接和特异性的药物干预节点，而TXNIP则嵌入更广泛的ceRNA和多转录因子调控架构中。
3.7 单细胞和实验分析揭示牙周炎中浆细胞相关的TXN/TXNIP改变
单细胞分析鉴定出12种细胞类型。与对照组相比，PD组的T细胞和浆细胞比例增加。TXNIP表达在PD患者的T细胞、内皮细胞（endothelial cells, ECs）、成纤维细胞（fibroblasts, FBs）和巨噬细胞（macrophages, MACs）中显著降低，但在浆细胞中升高；TXN表达在ECs、T细胞、浆细胞、MACs等多种细胞类型中显著下调。细胞-细胞通讯分析显示，对照组中浆细胞与其他细胞类型无相互作用，处于免疫孤立状态；而PD组中浆细胞与T细胞、巨噬细胞、B细胞和淋巴内皮细胞（lymphatic endothelial cells, LECs）活跃通讯。浆细胞与B细胞通过MIF-(CD74+CXCR4)信号轴的通讯概率增加，浆细胞与巨噬细胞之间的MIF-(CD74+CD44)信号也显著增强。小鼠PD模型的组织学和免疫荧光验证显示，TXN和TXNIP与CD138显著共定位，证实两者在浆细胞中表达；PD组中TXN表达显著降低而TXNIP表达显著升高。
3.8 拟时序轨迹分析揭示牙周炎中浆细胞亚型的功能异质性
拟时序轨迹分析鉴定出三种浆细胞亚型：Plasma_IgG4、IEG_NFKB和Plasma_IgA_JCHAIN。健康对照组中浆细胞主要归属于Plasma_IgG4亚型，而PD组中IEG_NFKB和Plasma_IgA_JCHAIN亚型增加。TXN和TXNIP的表达在拟时序进程中总体呈上升趋势。功能富集显示浆细胞富集于硒化合物代谢、N-连接糖基化、硫酸软骨素糖胺聚糖生物合成和维生素B6代谢等通路。不同浆细胞亚型表现出显著的基因表达特征差异：Plasma_IgG4亚型高表达IGHGP、IGKC和IGHG4等基因，富集于吞噬作用和补体激活，其表达沿拟时序轨迹下降；Plasma_IgA_JCHAIN亚型高表达基因同样富集于吞噬作用和补体激活，但表达沿拟时序增加；IEG_NFKB亚型高表达ATF3和PELI1等基因，主要富集于Toll样受体信号通路，其表达沿拟时序先增后减。
四、讨论与结论总结
讨论部分指出，PD的核心病理特征是氧化应激与炎症反应驱动的恶性循环。硫氧还蛋白（TXN）作为细胞氧化还原稳态的主要调节因子，通过其催化中心的二硫醇/二硫键交换有效清除活性氧（reactive oxygen species, ROS），保护细胞免受氧化损伤；而硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）作为TXN的主要内源性抑制因子，通过直接结合TXN的催化中心消除其抗氧化能力，并自主协调炎症小体激活、凋亡和代谢紊乱等病理事件。TXNIP过表达可促进SASP和线粒体功能障碍，而CLOCK失调已被证明可上调TXNIP表达，提示TXNIP是昼夜节律控制与氧化应激之间的潜在汇聚点。因此，TXN/TXNIP轴可能构成参与调节ROS积累和牙周炎症的调节轴，其表达平衡的破坏可能损害组织的氧化清除能力，导致氧化还原失衡和牙周膜凋亡、基质降解及进行性牙槽骨吸收。抗原加工呈递和凋亡被确定为关键通路，这两个通路可能介导关键基因在PD中的作用。免疫微环境分析揭示了TXN与活化B细胞的负相关及TXNIP与未成熟B细胞的正相关，单细胞分析进一步揭示了浆细胞在PD中从免疫孤立状态向广泛交互状态的转变，通过MIF信号轴参与局部免疫网络调节。药物预测提示藤黄酸和PX-12可作为靶向TXN的候选工具化合物，而靶向TXNIP可能需要涉及FAS配体或其相关网络节点的联合策略。研究结论指出，TXN和TXNIP可作为PD分类的候选分子工具，浆细胞与免疫调节的关联凸显了氧化应激与PD中免疫重塑之间潜在的机制联系。研究也承认了局限性，包括公共数据集缺乏关键临床协变量信息、药物预测基于计算关联而非药效学证据、动物实验仅验证表达和定位而未进行功能干预等，未来需纳入具有完整临床信息的前瞻性队列、开展功能实验和药理学验证，并在人类牙周炎组织中进行多重免疫荧光以确认浆细胞相关信号轴的空间分布。
