基于遗传密码扩展的ETV2翻译时相控制构建兼具血管网络、小胶质样细胞和血脑屏障特征的人脑类器官

《Advanced Science》：Expanding Genetic Code to Generate Human Brain Organoids with Both Vasculature and Microglia-Like Cells

脑类器官（brain organoids）为研究人脑发育和疾病提供了不可替代的模型系统。然而，建立具有多种细胞谱系（包括血管系统和免疫细胞）的高保真脑类器官仍是一项巨大挑战。在此，研究人员提出一种新策略，利用遗传密码扩展技术（GCE-T）通过位点特异性蛋白工程生成具有血管系统和小胶质样细胞（microglia-like cells）的人脑类器官。该策略将正交遗传翻译机器（GTM）整合至人多能干细胞（hPSCs）中，实现hPSC来源脑类器官中ETV2表达和内皮分化的时相控制。血管化人脑类器官（vhCOs）表现出多种细胞谱系的协调发育和血脑屏障（BBB）特征，并在移植到免疫缺陷小鼠后形成可灌注血管网络。单核RNA测序（snRNA-seq）揭示vhCOs中神经血管相互作用增强、多脑区身份、神经元亚型多样和特化内皮亚群，与人类胎儿脑高度相似。值得注意的是，研究人员在vhCOs中鉴定到富集的小胶质样细胞，包括三种不同亚型，其参与小胶质细胞-血管相互作用并协同调节血管发育。在寨卡病毒（ZIKV）感染后，vhCOs表现出神经血管功能障碍和小胶质细胞发育受损，为病毒诱导的神经发育障碍提供了新见解。该研究提供了一个独特平台，用于产生具有血管系统和免疫成分的更有价值脑类器官，为推进类器官研究和应用开辟新途径。

该论文发表于《Advanced Science》。人脑类器官（brain organoids）可重现早期甚至中孕期前脑关键特征，已用于脑发育和神经疾病研究。体内脑器官发生受多细胞类型时相调控，血管网络支持神经发育、脑区形成和功能成熟，小胶质细胞等免疫细胞参与免疫监视、神经元存活、突触形成和凋亡细胞清除。现有血管化脑类器官策略包括共培养、类器官融合和遗传诱导，但建立同时包含血管和免疫组分的高保真脑类器官仍困难。遗传密码扩展技术（GCE-T）可通过重编程tRNA/氨酰tRNA合成酶（aaRS）对和终止密码子实现非经典氨基酸（ncAA）位点特异性掺入，Van Husen et al.首次在脑类器官中展示GCE，但尚未充分用于3D组织或类器官的功能谱系工程。因此，研究人员尝试以GCE-T为发育工程工具，通过时相控制ETV2表达，生成同时具有血管化和小胶质样细胞的人脑类器官，并用于ZIKV感染建模。

关键技术方法方面，研究所用细胞系为H9 hESCs（WiCell, no. WB68075）与皮肤成纤维细胞来源iPSCs（Coriell Institute, GM25256）；ZIKV由安徽医科大学提供。研究人员通过PiggyBac转座将含MmPylRS/tRNA和A122位点提前终止密码子（PTC）的ETV2的GTM导入hPSCs，以NAEK诱导位点特异性通读。随后按脑类器官流程培养，在day18加入NAEK启动ETV2表达。主要技术包括免疫荧光、流式细胞术、qRT-PCR、Western blot、TEER、FITC-dextran灌注、MEA、免疫缺陷小鼠皮下移植与MRI、snRNA-seq及生物信息学分析，以及ZIKV感染。

2.1 在hPSCs中构建生物正交遗传翻译机器
研究人员建立H9^GTM和iPS^GTM细胞系，GTM含MmPylRS/tRNA和A122处PTC的ETV2；仅在NAEK存在时表达全长ETV2。H9^GTM保持多能性标志、核型、Sanger测序正确，20代稳定，能形成三胚层和畸胎瘤。2D中NAEK处理产生内皮样细胞并上调ETV2和VE-Cadherin。结论：生物正交GTM成功整合hPSCs。

2.2 通过GCE-T生成具有血管系统、小胶质样细胞和BBB特征的人脑类器官
H9^GTM形成EBs，day18加NAEK驱动ETV2，生成vhCOs。vhCOs生长更大，day180约4.5 mm；day30含SOX2⁺ NPC、TUJ1⁺神经元、CD31⁺ EC、血管腔样和COL4⁺/CD31⁺基膜。流式见CD31⁺约6.26%、CD140b⁺约6.58%、CD11b⁺约3.98%、CD68⁺约1.04%。光透明显示血管网络，BBB样结构有周细胞覆盖约90%、CD31/ZO-1共定位约80%、星形胶质终足覆盖约60%；day90 CD31⁺约9.27%。IBA1⁺小胶质样细胞增多，表达P2RY12、TREM2、TMEM119，LPS刺激后TNF-α和IL-6分泌增加。qRT-PCR示内皮、周细胞、小胶质、星形胶质和血管发生基因上调，多能性下调；无NAEK的H9^GTM无CD31、IBA1或PDGFRβ。iPS结果类似。TEER升高，FITC-dextran灌注显示可灌注性，MEA显示放电率、网络爆发时长和波幅更高。移植免疫缺陷小鼠后MRI高对比，FITC-dextran与人特异性CD31共定位。结论：GCE-T可生成多谱系、BBB特征和体内可灌注的vhCOs。

2.3 vhCOs的单核转录组分析
90天snRNA-seq显示，hCO有7个主要簇，主要来自神经谱系；vhCO有12个主要簇，包括中间祖细胞（IPC）、放射状胶质（RG）、成胶质细胞（GB）、神经内分泌细胞（NE）、上皮细胞（Epi）、神经元、内皮细胞和小胶质样细胞等。中胚层-造血祖细胞（Meso-hemato，表达KDR和GATA4）仅在vhCO检测到，提示可产生造血细胞、内皮和支持组织稳态的巨噬细胞。RNA velocity和拟时序显示vhCO外胚层与中胚层分离轨迹，血管化早期启动，小胶质早期出现，中期ECM基因上调，后期神经元成熟基因高表达。细胞通讯网络显示vhCO相互作用更广泛，激活JAM2、BMP、PTN等血管化通路及SEMA、EPHA、NOTCH、FGF、IGF、FN1、SPP1、CD99、TENASCIN、COLLAGEN、LAMININ、NRG、NRXN、NCAM等。RUNX1表达于中胚层/血管周和小胶质样细胞，qRT-PCR验证TREM2、P2RY12、TMEM119。结论：GCE-T实现多谱系时相协调。

2.4 vhCOs具有多脑区身份和多样神经元亚型
通过深度生成建模和迁移学习映射人胎儿全脑图谱，vhCO神经谱系区域分布更广，包括小脑、中脑和脑干，而hCO主要局限于皮层/前脑；GSVA验证多区域身份。映射人新皮层图谱，vhCO含成熟兴奋性神经元52%、抑制性神经元8%、Cajal-Retzius（CR）细胞7%；hCO主要为兴奋性神经元前体60%，抑制性神经元和CR细胞明显不足。映射受孕后第5周人原肠胚图谱显示vhCO比hCO更成熟。结论：vhCO具多脑区身份、神经元亚型多样性和更高成熟度。

2.5 vhCOs表现出增强的神经血管串扰
细胞通讯分析显示vhCO中EC、GB、神经元和血管周细胞间信号增强。GB主要为星形胶质；hCO星形胶质偏神经支持，vhCO星形胶质呈血管周相关转录特征。DEG和GO分析显示hCO富集小分子代谢，vhCO富集神经投射、轴突发生和血管发育。内皮亚群显示动脉型、tip型和静脉型EC扩展；血管周群含周细胞亚型、成纤维细胞、星形胶质和Schwann细胞。小胶质样细胞分三型：激活型55.3%、静息型33%、迁移型11.6%。激活型通过SPP1-integrin和ICAM信号与血管互动；迁移型分泌POSTN可能通过ECM稳定血管。NMF显示周细胞和EC为主要信号发送者，EPHA/EPHB和NRG参与；缺氧响应周细胞经ANGPTL促血管生成，JAM通路提示BBB成熟；Tip和动脉EC经NOTCH（DLL4、DLK1）、PTPRM和PGF-FLT1驱动血管生成。PeriVas_AS和AS_PeriVas分别参与ECM/血管中胚层和神经发育。A205804抑制E-selectin/ICAM-1后，小胶质粘附和激活减少，TEER和FITC通透性不变，提示ICAM-integrin信号对小胶质-血管串扰和协调发育必要。

2.6 vhCOs在寨卡病毒感染下显示神经血管功能障碍和小胶质样细胞发育受损
研究人员用ZIKV感染90天vhCOs 24 h后观察6天。感染后体减小，内皮网络损伤，SOX2⁺ NPC减少，ZIKV偏好感染NPC和TUJ1⁺神经元，小胶质样细胞发育受损。hCO中ZIKV感染NPC和神经元致死亡增加、增殖降低、神经元层体积减少，但无内皮或小胶质样细胞影响。感染vhCO的snRNA-seq显示细胞多样性下降、血管周/中胚层特征减弱、小胶质样细胞发育受损；STAT3、NFKB2、ATF4等免疫/炎症因子激活，NCAM、NRXN、NRG等神经发育通路下调。病毒基因组86.3%位于细胞碎片、9.7%位于完整神经细胞。与胎儿脑比较，56% EC获得免疫谱系转录特征；病毒响应基因在NPC、Mural细胞、EC、成纤维细胞和MSC富集；JAK、NF-κB、IFN-α、IFN-γ在EC富集，凋亡、自噬、神经退行和病毒复制在NPC、神经元和RG富集。32% NPC与胎儿脑成纤维细胞汇聚，UMAP更接近中胚层，亚群轨迹从正常代谢到中胚层发育，GO、GSEA和RNA velocity验证NPC-中胚层转化。结论：ZIKV导致神经血管功能障碍、NPC-中胚层转化和小胶质样细胞发育受损。

讨论指出，该工作首次使用位点特异性蛋白工程调控ETV2生成血管化脑类器官，翻译控制精确、泄漏低、响应快；时相控制ETV2使vhCOs协调血管和小胶质样细胞及BBB，体内可灌注，snRNA-seq显示增强神经血管互动和多脑区身份，小胶质样细胞三亚型协同调节血管发育。与Sun et al.融合血管和脑类器官、Abud et al.共培养、Ormel et al.共分化及Cakir et al. ETV2调控相比，本研究在day18延迟诱导，保留生血潜能并产生GATA4⁺祖细胞，同时生成内皮和小胶质。小胶质样细胞可在标准维持培养基无外源营养因子存活，可能与IL34表达兴奋性神经元、CSF1表达放射状胶质和TGFβ表达祖细胞提供的信号有关。长期稳定仍需研究，包括超过90至180天的稳定性、周细胞-内皮相互作用、基质降解和小胶质稳态；原位脑移植6–12个月是未来方向。snRNA-seq中神经谱系比例相对下降归因于中胚层群体扩张而非神经发育缺陷；vhCOs神经元亚型更广、更成熟，MEA和细胞通讯增强。中胚层谱系可能源于GATA4⁺上皮祖细胞，而非神经-血管转分化；Meso-hemato与内皮/小胶质关系仍为相关性，需要谱系示踪和GATA4或RUNX1敲除建立因果。GCE-T调控ETV2激活NOTCH和BMP。ZIKV感染导致血管损伤、神经发生破坏、小胶质异常和先天免疫激活，提示胎儿脑神经血管功能障碍；ZIKV诱导NPC中胚层转化可能是慢性感染适应。该平台还可用于阿尔茨海默病（AD）、脑血管病和神经炎症疾病。

研究结论翻译：综上所述，这种基于GCE的方法通过位点特异性ETV2蛋白工程，为生成具有功能性血管系统和免疫组分的脑类器官提供了新范式，其忠实重现人胎儿脑的发育轨迹。该工作的新颖性在于能够利用GCE-T生成具有多种细胞谱系协调发育的脑类器官，包括血管系统和小胶质样细胞，这是现有方法不易实现的。研究人员的GCE-T系统不限于ETV2调控；其核心设计是生物正交tRNA/tRNA合成酶对，可实现任何目标基因的非经典氨基酸依赖性翻译控制，使其成为精确、时相控制转录因子、信号分子甚至形态素梯度以工程额外类器官模型的通用平台。该工作提供了一种新的协同策略来工程高保真脑类器官，推进类器官研究和生物医学应用。