星形胶质细胞通过AQP4/TRPA1/BEST1/D-丝氨酸信号在长时感觉需求中协调神经血管耦合

《Advanced Science》：Astrocytes Coordinate Neurovascular Coupling During Prolonged Sensory Demand via AQP4/TRPA1/BEST1/D-Serine Signaling

　　

星形胶质细胞被公认为神经血管耦合（neurovascular coupling, NVC）的关键组分，然而星形胶质细胞参与NVC是否及如何依赖于感觉刺激时长仍不清楚。研究人员通过比较短暂（5 s）与长时（20 s）感觉刺激下的神经血管反应，研究长时需求下脑血容量（cerebral blood volume, CBV）调控的时长依赖性星形胶质细胞机制，结合在体本征光学信号（intrinsic optical signal, IOS）成像、双光子显微镜、电生理与血管插管技术发现：长时刺激选择性招募由水通道蛋白-4（aquaporin-4, AQP4）介导的体量变化、机械敏感瞬时受体电位锚蛋白1（transient receptor potential ankyrin 1, TRPA1）的Ca2+内流，以及Ca2+依赖的Bestrophin-1（BEST1）通道释放D-丝氨酸（D-serine）所构成的整合信号级联；该级联驱动持续神经元活动，导致CBV调制与感觉感知。遗传消融该通路各组分仅损害长时刺激下的CBV反应、神经元活动与感觉行为，而外源D-丝氨酸可完全恢复上述缺陷。研究人员进一步证明，经由BEST1的强直性星形胶质细胞D-丝氨酸释放直接调节穿支小动脉的基础张力。这些发现确立星形胶质细胞D-丝氨酸为长时感觉需求下调控CBV与神经元活动、并在静息态微调血管张力的重要胶质递质。

研究背景方面，大脑通过功能性充血即神经血管耦合（neurovascular coupling, NVC）调节脑血流（cerebral blood flow, CBF）以满足代谢需求，神经元、星形胶质细胞、壁细胞、内皮细胞与血管构成神经血管单元（neurovascular unit, NVU）。已有研究提示星形胶质细胞Ca²⁺升高可释放前列腺素E2、花生酸类、ATP、一氧化氮（nitric oxide, NO）、K⁺等血管活性介质；但其对NVC的贡献存在争议，可随刺激时长、血管区段、行为状态而改变。尤其近期证据表明长时神经元激活下星形胶质细胞才更充分参与NVC，但长时刺激为何及如何选择性招募星形胶质细胞机制不明。AQP4作为星形胶质细胞终足主要水通道，调控体量变化；体量改变可激活机械敏感TRP通道，其中TRPA1介导入Ca²⁺而非IP₃R通路；Ca²⁺升高又可经BEST1释放D-丝氨酸，D-丝氨酸是N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）共激动剂，还可作用于内皮NMDAR引起血管舒张。因此，AQP4/TRPA1/BEST1/D-丝氨酸是否在体内NVC中发挥作用、是否解释长时刺激下星形胶质细胞选择性参与、以及是否调节静息血管张力，均是未解问题。该论文发表于《Advanced Science》，研究人员以此切入，系统比较短暂与长时感觉刺激，揭示时长依赖性星形胶质细胞信号如何连接持续神经元活动、CBV与感觉感知，并发现静息态下强直性D-丝氨酸释放调控基底血管张力。

主要关键技术方法方面，研究人员以C57BL/6小鼠及TRPA1敲除（knockout, KO）等遗传模型为样本，采用立体定位皮层注射AAV实现星形胶质细胞特异性AQP4、TRPA1、丝氨酸消旋酶（serine racemase, SR）、BEST1基因沉默或条件性敲除；在体用IOS成像测CBV、双光子显微镜同时记录星形胶质细胞GCaMP6f的Ca²⁺信号与穿支小动脉直径、局部场电位（local field potential, LFP）记神经元活动、von Frey纤毛测清醒小鼠感觉阈值；离体脑片用全细胞膜片钳记录神经元强直性NMDAR电流、经缝隙连接偶联的星形胶质体网灌流D-丝氨酸、血管插管测穿支小动脉张力；并辅以免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）与邻近连接分析（proximity ligation assay, PLA）验证AQP4与TRPA1空间接近。

研究结果方面，2.1 星形胶质细胞AQP4通道参与CBV、神经元活动与感觉感知：研究人员通过S1FL区AQP4 shRNA证明，短暂刺激下AQP4缺失仅略减CBV峰值，长时刺激则显著降低CBV峰值与曲线下面积（area under the curve, AUC），穿支小动脉扩张幅度与持续性受损，软脑膜动脉主要减AUC；LFP显示基础神经元活动不变，短暂刺激神经元反应保留，长时刺激神经元持续活动不能维持；von Frey显示前爪感觉阈值升高而 hindpaw 无变化，说明AQP4是长时感觉处理与感知所必需。

2.2 星形胶质细胞AQP4调控活动依赖性体量反应与Ca²⁺信号：脑片IOS与GCaMP6f成像显示AQP4沉默使短暂与长时刺激的体积变化降低约60–70%，星形细胞Ca²⁺峰值与AUC均下降；Co-IP与PLA表明AQP4与TRPA1同复合体且空间接近（<40 nm），支持二者共享信号机制但并非证明直接门控。

2.3 星形胶质细胞TRPA1在长时刺激中选择性参与Ca²⁺信号与小动脉扩张：在体双光子显示短暂刺激下TRPA1敲低不改变Ca²⁺与小动脉直径，长时刺激下星形细胞Ca²⁺反应显著减弱，穿支小动脉峰值扩张与AUC下降，表明TRPA1依赖成分在长时中被招募。

2.4 星形胶质细胞TRPA1是长时刺激后CBV、神经元活动与感觉感知所必需：IOS显示短暂刺激CBV正常，长时刺激峰值、半峰时间、AUC均减；LFP见长时神经元活动受损；von Frey前爪阈值升高；全局TRPA1 KO表现更早更广改变，反衬星形细胞TRPA1特异性削减晚期相。

2.5 星形胶质细胞TRPA1是D-丝氨酸释放所必需：膜片钳测APV敏感强直性NMDAR电流，TRPA1敲低使该电流、D-丝氨酸诱导电流偏移（ΔD-serine）与甘氨酸调节位点占用率下降；星形细胞SR敲低也降基础D-丝氨酸水平，神经元SR敲低无此效，说明星形细胞TRPA1经D-丝氨酸维持NMDAR张力。

2.6 D-丝氨酸恢复TRPA1敲低鼠的CBV、神经元活动与感觉感知：腹腔给D- serine 2 h后，对照组CBV不变，TRPA1敲低鼠长时刺激CBV峰值、AUC恢复，LFP神经元峰值恢复，von Frey前爪阈值回至对照，证明D-丝氨酸是该通路效应分子。

2.7 星形胶质细胞D-丝氨酸经BEST1直接控制神经元NMDAR电流与穿支小动脉基础张力：脑片中将D-丝氨酸灌入星形细胞同步网，神经元强直性NMDAR电流增强；BEST1 KO及星形细胞BEST1条件性KO中该增强消失。血管插管用TXA2类似物U46619建立张力后，星形细胞D-丝氨酸引起野生型穿支小动脉渐进舒张，kynurenic acid（KA）使之降到基础以下，BEST1 KO无此反应；TTX存在时D-丝氨酸仍舒张血管，支持非神经元NMDAR如内皮NMDAR与eNOS依赖机制；在体双光子也见腹腔D-丝氨酸直接扩张穿支小动脉。

讨论部分总结方面，研究人员提出短暂刺激引发瞬态神经元激活与CBV反应，不依赖星形细胞该级联；长时刺激使K⁺外排、星形细胞摄取后渗透压升高，AQP4引水致体积改变，招募TRPA1的Ca²⁺内流，再经BEST1释D-丝氨酸，增强神经元GluN1含NMDAR并维持CBV晚期相。该通路是补充而非启动NVC，因敲除不改反应起始而改幅度与持续。静息时强直性D-丝氨酸经BEST1和内皮NMDAR调基础血管张力。研究局限包括乌拉坦麻醉、急性窗、von Frey难评时长性行为；未来需在觉醒鼠与慢性窗验证。

结论部分翻译：研究人员将星形细胞AQP4/TRPA1/BEST1/D-丝氨酸信号确立为一种新型整合分子机制，可在皮质活动需长时间维持时防止神经元与血管反应逐步衰减；并确认星形细胞D-丝氨酸是基底血管张力的调节因子，凸显星形细胞塑造静息神经血管状态的作用。综上，该结果提出星形细胞是支撑长时皮质处理与血管稳定的关键整合者。鉴于AQP4及相关信号异常牵涉阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）、卒中与创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI），该发现为生理与病理情境下的神经血管功能障碍研究提供机制性见解。