靶向小胶质细胞HDAC5通过NF-κB p65去乙酰化抑制NLRP3炎症以减轻缺血性脑损伤

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Targeting Microglial HDAC5 Suppresses NLRP3 Inflammation via NF-κB Deacetylation to Alleviate Ischemic Brain Injury

　　

目的：组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）与缺血性脑卒中相关，但HDAC5的作用仍不明确。本研究旨在确定脑缺血后HDAC5的病理意义，阐明其参与缺血后NF-κB p65/NLRP3（NOD-like receptor family pyrin domain containing 3）信号转导，并评估一种靶向HDAC5的基于细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）的治疗策略。

方法：在小鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型中，通过蛋白质印迹和免疫荧光检测缺血损伤后HDAC5表达。在BV2细胞和MCAO小鼠中通过功能获得和功能缺失实验评估其功能。通过TTC（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride）染色、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、彩色多普勒成像和行为测试评估梗死体积、脑血流量和神经功能恢复。采用共免疫沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）、乙酰化分析和胞质/核分离探索潜在机制。进一步测试负载miR-9-5p并经RGD肽（Arg-Gly-Asp peptide）修饰的人神经干细胞来源EV作为靶向治疗方法。

结果：HDAC5在MCAO后显著上调，主要定位于缺血核心区的神经元和缺血半暗带的小胶质细胞，同时NLRP3表达增加。在BV2细胞中，HDAC5过表达增加NLRP3表达，而HDAC5敲低降低其表达。在体内，AAV（adeno-associated virus）介导的HDAC5敲低降低NLRP3水平，减小梗死体积，改善血流恢复，并改善MCAO后运动缺陷。机制上，HDAC5与NF-κB p65而非NLRP3相互作用。HDAC5敲低增加p65乙酰化并减少其核转位，与抑制NLRP3相关炎症信号一致。此外，工程化RGD-EV:miR-9-5p被小胶质细胞有效摄取，抑制HDAC5和NLRP3表达，并改善MCAO后组织学和功能结局。

结论：这些发现将HDAC5确定为缺血后炎症损伤的一个既往未被充分重视的调节因子，并支持HDAC5/NF-κB p65/NLRP3轴在脑缺血中的作用。因此，工程化RGD-EV:miR-9-5p可能代表缺血性脑卒中的一种有前景的靶向治疗策略。

缺血性脑卒中（ischemic stroke）是全球死亡和长期残疾的主要原因之一，缺血性卒中占大多数。脑动脉闭塞中断血供，剥夺脑组织氧和葡萄糖，引发兴奋性毒性、氧化应激、炎症和细胞死亡。重组组织型纤溶酶原激活剂（recombinant tissue plasminogen activator，tPA）是当前唯一获批的药物治疗，但治疗窗窄。蛋白乙酰化和去乙酰化对维持中枢神经系统稳态至关重要，缺血损伤后明显紊乱；组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）动态调节该平衡。既往研究多关注I类HDAC，而II类HDAC在核质间穿梭，也参与缺血病理。HDAC5属于II类HDAC，在血管生成、轴突再生和炎症调节中受关注，但脑缺血后尤其神经炎症中的作用不清。同时，卒中治疗还需要有效递送策略。细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）因其小尺寸、生物相容性和递送功能性RNA能力成为有前景的非细胞载体。RGD（Arg-Gly-Asp）肽修饰可靶向整合素α_vβ₃，该受体在脑缺血后血管内皮细胞和小胶质细胞中明显上调。因此，研究人员旨在确定HDAC5在脑缺血后的病理意义，阐明其参与NF-κB p65/NLRP3信号，并评估靶向HDAC5的EV治疗策略。

研究人员在缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）模型和BV2小胶质细胞中开展研究。结果显示，HDAC5在I/R后显著上调，并与NLRP3表达升高相关；HDAC5正向调控NLRP3，AAV（adeno-associated virus）介导的Hdac5敲低减轻缺血性脑损伤，支持HDAC5作为卒中潜在治疗靶点。机制上，HDAC5与NF-κB p65相互作用并降低其乙酰化、促进核转位，进而间接促进NLRP3转录。研究人员还开发了负载miR-9-5p的RGD修饰EV系统，显示RGD-EV:miR-9-5p至少部分通过调节HDAC5/NF-κB p65/NLRP3信号轴保护缺血后脑损伤。该研究的重要意义在于识别HDAC5为既往未被充分重视的缺血后炎症损伤调节因子，并将表观遗传调控与卒中后神经炎症及靶向递送策略联系起来。

技术方法概括：研究使用8–10周、25–30 g雄性C57BL/6小鼠，来源为南京医科大学动物核心设施；采用大脑中动脉闭塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型。细胞包括ReN人胎儿神经祖细胞系、HEK293T、HT-22和BV2细胞；无人类样本。主要关键技术包括TTC（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride）染色、激光多普勒、MRI（magnetic resonance imaging）、行为测试、AAV介导Hdac5敲低、BV2细胞功能获得/缺失、共免疫沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）、乙酰化分析、胞质/核分离、分子对接、双荧光素酶报告实验、EV分离与RGD修饰及miR-9-5p装载、近红外荧光（near-infrared fluorescence，NIRF）成像。

研究结果如下：

3.1 HDAC5 Is Upregulated in a Cell Type–Specific Manner After I/R, Accompanied by Increased NLRP3 Expression（HDAC5在I/R后以细胞类型特异性方式上调，并伴随NLRP3表达增加）。研究人员通过TTC染色、激光多普勒、神经评分、免疫荧光和western blot发现，I/R后右侧半球梗死、血流阻塞和功能缺陷；海马CA1区神经元丢失伴DNA双链断裂。HDAC5表达在48 h增加并持续至72 h；在缺血半暗带主要定位于Iba-1阳性小胶质细胞，在缺血核心主要定位于NeuN阳性神经元，与GFAP阳性星形胶质细胞无明显共定位。NLRP3在I/R后显著升高，48 h达峰，呈点状分布，与HDAC5上调时间吻合。

3.2 HDAC5 Promotes NLRP3 Expression and Contributes to Brain Injury After I/R（HDAC5促进NLRP3表达并参与I/R后脑损伤）。在BV2细胞中，Hdac5过表达增加NLRP3蛋白；siRNA或慢病毒shRNA敲低降低NLRP3表达；LPS和nigericin刺激后Hdac5敲低仍降低NLRP3并减少点状聚集。小鼠右侧皮质立体定向注射AAV-shHDAC5，敲低效率经荧光和western blot确认；Hdac5敲低改善脑血流，减少海马CA1神经元DNA损伤，降低缺血皮质和小胶质细胞NLRP3表达。

3.3 Hdac5 KD Reduces Infarct Volume and Promotes Neurological Recovery After Cerebral Ischemia（Hdac5敲低减少脑缺血后梗死体积并促进神经功能恢复）。转棒和平衡木测试显示，AAV注射不影响基线运动；MCAO后AAV-shHDAC5组在第3、5、7天转棒停留时间增加、平衡木通过时间减少。MRI显示Hdac5敲低显著减少梗死体积。

3.4 HDAC5 Promotes NLRP3 Transcription by Regulating NFκB p65 Deacetylation（HDAC5通过调节NFκB p65去乙酰化促进NLRP3转录）。Co-IP显示HDAC5与NLRP3无直接相互作用。HDOCK分子对接预测HDAC5与NF-κB p65有良好结合模型，Co-IP确认二者相互作用。Hdac5敲低增加BV2细胞NF-κB p65乙酰化；但Lys310位点未检测到特异条带，提示该位点可能不介导此效应。Hdac5敲低增加胞质p65并减少核p65，表明核转位受损。JASPAR预测NLRP3启动子存在NF-κB p65结合位点。结论是HDAC5通过结合并去乙酰化NF-κB p65、促进其核转位，间接促进NLRP3转录。

3.5 Engineering and Characterization of RGD-EV:miR-9-5p（RGD-EV:miR-9-5p的工程化与表征）。ReN来源EV减轻MCAO小鼠缺血损伤。RNA-seq显示ReN-EV富含多种microRNA；RT-PCR显示miR-9-5p在ReN-EV中高富集。HT22细胞OGD后miR-455-3p、miR-455-5p和miR-9-5p响应明显，EV处理可恢复其水平，miR-9-5p最显著。TargetScan预测并经双荧光素酶实验证实miR-9-5p直接结合Hdac5 3′UTR；miR-9-5p过表达降低BV2细胞HDAC5。随后将胆固醇修饰的miR-9-5p与RGD肽/Cy5.5通过两步法偶联至EV，TEM和NTA显示EV形态大小未变。体内NIRF显示RGD-EV:miR-9-5p靶向缺血脑区，RGD-EV可被小胶质细胞摄取，EV:miR-9-5p降低BV2细胞HDAC5表达。

3.6 RGD-EV:miR-9-5p Suppresses NLRP3-Associated Inflammation and Exerts Neuroprotective Effects, Potentially Through Targeting Hdac5（RGD-EV:miR-9-5p抑制NLRP3相关炎症并发挥神经保护作用，可能通过靶向Hdac5）。BV2细胞中EV:miR-9-5p预处理降低LPS诱导的NLRP3蛋白。体内I/R后尾静脉注射RGD-EV:miR-9-5p减少梗死周边区小胶质细胞激活和NLRP3点状聚集，减少梗死体积，改善神经评分，MRI证实病灶缩小。结论：RGD-EV:miR-9-5p可能通过抑制HDAC5/NLRP3信号轴发挥神经保护。

讨论部分指出，HDAC5在心脏、脑、肺和骨骼肌高表达，并在缺氧和代谢应激下上调，但脑I/R后研究有限且结果不一致。本研究显示HDAC5在再灌注24 h先降低、48–72 h明显升高，且缺血核心以神经元为主、半暗带以小胶质细胞为主，提示不同细胞群中作用不同。NLRP3炎症小体是组织损伤后无菌炎症的关键介质，脑缺血后NLRP3升高，抑制可神经保护。NLRP3相关信号受磷酸化、泛素化和乙酰化等翻译后修饰调控，其中乙酰化作用尚不明确。研究人员发现HDAC5不直接去乙酰化NLRP3，而是与NF-κB p65相互作用，降低其乙酰化并促进核积累；既往研究提示p65乙酰化削弱DNA结合并促进IκBα依赖的核输出，因此HDAC5介导的p65去乙酰化可增强核滞留和包括NLRP3在内的下游炎症基因转录，支持HDAC5/NF-κB p65/NLRP3轴。治疗上，miR-9-5p的选择基于实验观察：其在ReN-EV中富集，OGD后BV2中降低，ReN-EV可恢复；miR-9-5p过表达降低cleaved caspase-1和IL-1β，提示抑制NLRP3相关炎症。RGD修饰靶向缺血后小胶质细胞上调的整合素α_vβ₃，实现静脉递送。RGD-EV靶向能力经荧光成像定量，其生物分布和安全性已在此前研究建立。局限性包括：使用全局AAV介导Hdac5敲低而非细胞类型特异性操作，无法完全区分小胶质细胞和神经元贡献；未进行p65 rescue实验，精确乙酰化位点未确定，不能确定p65为必需介质；miR-9-5p可能调节HDAC5以外靶点；重复给药的长期疗效、生物分布和安全性需进一步评估。

结论翻译：总之，研究人员证明I/R后HDAC5水平显著升高，48 h在小胶质细胞中表达增加。数据支持HDAC5上调与NLRP3相关炎症信号之间的关联，可能通过与NF-κB p65相互作用并使其去乙酰化实现。作为一种潜在的脑缺血治疗策略，RGD-EV:miR-9-5p调节HDAC5表达并减轻缺血性脑损伤，体内和BV2细胞发现支持小胶质细胞相关炎症调节的作用。