改良方法同步建立患者来源胶质母细胞瘤类器官（GBO）与原代细胞：一种低样本需求、简化通用的颅内肿瘤模型构建策略

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Improved Method for Obtaining Patient-Derived Glioblastoma Organoid and Primary Cells: A Generic and Simplified Approach for Intracranial Tumor With Minimized Input

引言：胶质母细胞瘤（glioblastoma）是成人中最恶性的原发性肿瘤之一。传统肿瘤模型的短缺阻碍了基础研究和治疗模式的发展。类器官（organoid）的应用对于保持肿瘤异质性（tumor heterogeneity）和微环境（microenvironment）至关重要。当前生成胶质母细胞瘤类器官的方法复杂、费力且不便。
方法：研究人员从患者收集胶质母细胞瘤组织样本，并使用改良方法生成类器官。随后，利用该过程中收集的悬液分离原代肿瘤细胞（primary tumor cells）。类器官用于评估其药物敏感性（drug susceptibility）。最后，研究人员用相同方法生成其他中枢神经系统（central nervous system，CNS）肿瘤的类器官。
结果：改良方法耗时更少并降低技术要求。用改良方法生成的胶质母细胞瘤类器官可培养用于进一步研究。从收集的培养基中分离的原代胶质母细胞瘤细胞经免疫荧光（immunofluorescence）证实。患者来源胶质母细胞瘤类器官显示出与患者一致的药物敏感性。肿瘤类器官也成功地从患者的淋巴瘤（lymphoma）和低级别胶质瘤（low-grade glioma）样本中生成。
结论：研究人员改良了一种更简单、更快速的方法，从组织样本生成胶质瘤（glioma）类器官，并避免浪费所用培养基中的原代肿瘤细胞。该方法为类器官在神经肿瘤学（neuro-oncology）肿瘤研究和临床决策中的广泛应用奠定了技术基础。

研究背景：胶质母细胞瘤（glioblastoma）是成人中枢神经系统（central nervous system，CNS）最常见的恶性癌症，具有侵袭性，患者预后差。最大范围手术切除后放疗和化疗是当前标准临床治疗，但大量临床前尝试中仅少数治疗在临床试验中显示一致疗效，患者诊断后存活超过5年者少。目前术后辅助治疗决策依赖肿瘤基因分型，但患者间异质性常导致放疗和化疗反应不同，造成复发和转移。传统模型如细胞系和动物模型存在固有局限，可能导致临床转化失败。类器官（organoid）可模拟天然结构和异质性，已用于胰腺、肺、肝等肿瘤研究。既往GB样类器官和GLICO等模型，以及用Matrigel和 exogenous growth factors 培养胶质母细胞瘤干细胞（glioblastoma stem cells，GSCs）形成三维（three-dimensional，3D）结构的方法，存在肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）保留不完全、关键基质和细胞群选择性缺失等问题。Jacob et al.报道了不用Matrigel从肿瘤块生成胶质母细胞瘤类器官（GBO）的方法，可维持星形胶质细胞、小胶质细胞甚至毛细血管，但需立体显微镜和解剖剪，将肿瘤剪成极小块，操作技术要求高、耗时长、限制处理体积。其他CNS肿瘤如低级别胶质瘤、淋巴瘤、垂体瘤和转移瘤也缺乏更好体外模型。因此，需要一种步骤简单、设备常见、可推广的改良方法。

研究人员开展了改良GBO生成与培养研究，并同时从生成过程中收集的悬液分离患者来源原代胶质母细胞瘤细胞。研究人员还用药敏实验比较GBO与患者临床预后，并用同一方法生成其他CNS肿瘤类器官。结论是：改良方法更省时、技术门槛更低、成功率较高，可同时获得类器官和原代细胞，GBO能维持亲本肿瘤结构和分子特征，并可能用于患者个体化治疗评估；其他CNS肿瘤类器官也可用此方法建立。该研究为类器官在神经肿瘤学基础研究和临床决策中的广泛应用提供技术基础。

关键技术与样本来源：患者肿瘤样本来自上海交通大学医学院附属仁济医院神经外科，自2023年起手术切除并经WHO病理分类初步诊断，共22例CNS原发肿瘤，包括胶质母细胞瘤18例、室管膜下瘤1例、间变性室管膜瘤1例、胶质肉瘤1例、弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma）1例。技术核心为：肿瘤组织在1 h内处理，手工剪碎至直径小于1.0 mm，红细胞裂解后在非TC处理6孔板中，以DMEM/F12与Neurobasal-A为基础培养基，置于37°C、5% CO₂、90%湿度、120 rpm摇床培养；收集洗涤用保存液，经过滤离心分离原代细胞；GBO可传代、冻存和复苏；以苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，H&E）染色、全外显子测序（whole-exome sequencing）、免疫荧光、生长曲线和替莫唑胺（temozolomide）药敏实验进行评估。

研究结果：
3.1 改良方法在建立胶质母细胞瘤类器官模型中的应用：研究人员改良Jacob et al.方法，从18例患者来源胶质母细胞瘤样本成功建立15个GBO模型，成功率83%。一般5 mL肿瘤可在2 h内剪碎；多数类器官在1至2周内形成，外观一致，并可传代、储存、复苏和长期培养。
3.2 GBOs维持结构性和分子性瘤内异质性：通过H&E染色和全外显子测序比较同一患者的亲本肿瘤组织、原代类器官、传代类器官和复苏类器官。GBO显示亲本肿瘤的核异型性和丰富多形核；GBO与亲本肿瘤单核苷酸变异（single nucleotide variants，SNVs）重叠为86.8%，原代与传代GBO为88.8%，原代与复苏GBO为88.4%；插入缺失（insertions and deletions，InDels）分析也显示高度相似。
3.3 利用改良的肿瘤类器官生成方法分离原代胶质母细胞瘤细胞：研究人员从生成GBO过程中收集的培养基中成功分离原代胶质母细胞瘤细胞。原代细胞形态不同，免疫荧光证实CD133特征；本方法分离的原代细胞CD133阳性率高于传统胰酶消化法；原代细胞可长期培养和储存。
3.4 GBOs用于评估患者治疗敏感性和提供个体治疗：研究人员对两例患者GBO使用160 μM替莫唑胺处理，分析生长曲线并随访患者。不同患者GBO药物敏感性不同。患者G231021的GBO生长率为对照组的92%，患者使用替莫唑胺1年后复发；患者G230921的GBO生长率为对照组100%，随访中失访。研究提示GBO体外药物敏感性可能与患者临床治疗易感性相关。
3.5 用改良方法从其他原发性CNS肿瘤生成类器官：研究人员收集室管膜下瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤样本，用相同方法成功生成类器官。淋巴瘤类器官为小球形结构、代谢较低，体积小于GBO；室管膜下瘤类器官结构不规则、边缘光滑。尽管体积、外观和代谢与胶质母细胞瘤类器官不同，它们也在2周内形成并持续生长。

讨论部分总结：讨论指出，胶质母细胞瘤独特微环境对肿瘤发生发展重要，建立可模拟该微环境的体外模型对基础研究和临床改进关键。Jacob et al.方法虽能维持遗传异质性和微环境，但复制困难、需特殊设备、操作技术要求高、耗时且处理组织量受限。其他改进方法也存在不足，如Chun-Chung Chen et al.方法成功率低且特定肿瘤样本不足；Ana?s Oudin et al.方法不用摇床但忽略红细胞影响；Aurélie Soubéran et al.方法需要组织切片机，可能更适合商业用途；Kalil G. Abdullah et al.首次用于低级别胶质瘤并鼓励了颈髓肿瘤类器官工作；Tianping Peng et al.的肿瘤类器官与脑类器官共培养系统更难操作和推广。相比之下，本方法更简单、快速、成功率高且不依赖特殊设备，可从更多肿瘤样本生成类器官；证明脊髓肿瘤也可如脑肿瘤生成肿瘤类器官；首次允许在建立GBO同时从收集培养基分离原代肿瘤细胞，同一患者来源的2D和3D模型可经济、高效、同步建立，为类器官实验和PDX（patient-derived tumor xenograft，患者来源肿瘤异种移植）等提供支持。讨论也指出，放化疗后复发胶质母细胞瘤样本难以生成类器官，研究人员假设与肿瘤干细胞减少有关，并正在探索；原代细胞短期贴壁培养，长期培养时悬浮培养可能更好。当前标准治疗为最大手术切除后放化疗，疗效靠随访评估，患者异质性使预后难预测，新疗法临床试验耗时且常失败。两例患者MGMT（O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶，O-6-methylguanine-DNA methyltransferase）均为非甲基化且随访预后差，但病程不同；GBO可能模拟患者情况，与肿瘤干细胞来源类器官敏感性一致，有望用于建议个体治疗。类器官毛细血管结构对模拟微环境和药物渗透重要，但GBO中血管少，药物难达中心，未来拟分离血管内皮细胞建立血管化GBO。当前肿瘤类器官应用集中于化疗，放疗和肿瘤电场治疗（tumor-treating field，TTF）难以在实验室实施，需新设备，研究人员正在开发微流控芯片。除GBM外，CNS肿瘤类器官模型少；本研究成功生成室管膜下瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤类器官，二者与GBO有相似也有差异；弥漫大B细胞淋巴瘤类器官直径约200至300 μm，不能在GBO培养基中持续生长；室管膜下瘤类器官直径约500 μm，较早出现中央坏死。结果证明改良方法可能用于其他CNS肿瘤类器官生成，研究人员假设脑组织高含水量导致不同脑肿瘤在液体培养基中生成类器官方法一致，但培养过程和条件应按肿瘤类型调整。

研究结论翻译：研究人员从胶质母细胞瘤患者手术样本出发，报告了一种同步、简便、快速且经济地生成胶质母细胞瘤类器官的改良方法。通过该方法，可在更短时间内以高成功率生成更多类器官，并可同时分离原代肿瘤细胞。研究人员还对胶质母细胞瘤类器官进行体外实验，评估其在预测患者预后、建议术后治疗以及为临床试验寻找合适实验对象方面的潜在适用性。最后，研究人员用改良方法从两例患者肿瘤样本中成功生成室管膜下瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤类器官。该研究提供了一种生成CNS肿瘤类器官作为真实体外模型的简化方法。CNS肿瘤研究人员将从该方法的改进中受益，患者将从医学研究的发展中受益。