内质网应激（ER stress）调控HIV Tat与乙醇共暴露诱导的星形胶质细胞NLRP6炎症小体激活

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：ER Stress Regulates HIV Tat and Alcohol-Induced NLRP6 Activation in Astrocytes

　　

引言：慢性酒精消费在HIV感染者（people living with HIV, PLWH）中常见，并加重HIV相关神经认知障碍（HIV-associated neurocognitive disorders, HAND）。HIV-1反式激活因子（transactivator of transcription, Tat）与乙醇协同促进神经炎症，但其潜在分子机制仍不清楚。本研究旨在确定内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激是否调节星形胶质细胞NLRP6炎症小体对HIV Tat与乙醇共暴露的反应性激活。方法：将小鼠原代星形胶质细胞单独或联合暴露于HIV Tat（50 ng/mL）和乙醇（50 mM）。采用western blotting、免疫细胞化学、qPCR和ELISA评估星形胶质细胞激活、NLRP6炎症小体信号、促炎细胞因子产生和ER应激反应。使用4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid, 4-PBA）抑制ER应激，并使用siRNA沉默NLRP6以确定通路层级。结果：与单独处理相比，HIV Tat与乙醇联合暴露显著增加星形胶质细胞激活、NLRP6表达、caspase-1切割以及IL-1β和IL-18产生。共暴露还显著诱导ER应激标志物BiP、ATF6和磷酸化eIF2α。药理学抑制ER应激抑制NLRP6炎症小体激活和星形胶质细胞反应性，而NLRP6敲低减弱炎症信号但不影响ER应激标志物，表明ER应激作用于NLRP6上游。结论：这些发现确定一个ER应激–NLRP6炎症小体轴，作为HIV Tat和乙醇诱导星形胶质细胞神经炎症的潜在机制，为与HAND相关的酒精相关神经炎症过程提供机制见解。

研究背景方面，HIV感染与酒精使用障碍（alcohol use disorder, AUD）常共存。世界卫生组织指出，饮酒通过损害免疫能力和整体健康加速HIV疾病进展。美国流行病学研究显示，HIV感染者（people living with HIV, PLWH）更可能危险饮酒，进而加重免疫抑制、增强病毒复制并增加神经和肝脏并发症风险。慢性酒精暴露还恶化神经认知结局，增加HIV相关神经认知障碍（HIV-associated neurocognitive disorders, HAND；统称NeuroHIV）和其他神经精神表现。星形胶质细胞（astrocytes）是中枢神经系统（central nervous system, CNS）最丰富的胶质细胞类型，对维持神经元稳态、突触功能和神经免疫平衡至关重要。在HIV感染或酒精暴露等病理条件下，星形胶质细胞发生反应性转化，表现为胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）上调和促炎介质分泌。这种星形胶质细胞反应性破坏神经元微环境，促进慢性神经炎症和神经退行性变，是NeuroHIV的核心特征。此类应激下星形胶质细胞激活被认为涉及固有免疫传感器炎症小体（inflammasomes），其协调白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）和白细胞介素-18（interleukin-18, IL-18）的成熟和释放，从而放大神经炎症信号。炎症小体家族中，NLRP3炎症小体在胶质细胞中已被广泛表征，而NLRP6在CNS中的作用很大程度上尚未探索。NLRP6传统上被认为参与肠道免疫稳态和黏膜防御，最近被牵涉到无菌性炎症和代谢调节，提示其也可能参与神经免疫信号。研究人员前期发现酒精暴露激活星形胶质细胞NLRP6，揭示酒精增强神经炎症的先前未识别分子机制。HIV Tat（HIV-1 transactivator of transcription）是一种从感染细胞释放的神经毒性病毒蛋白，破坏线粒体完整性和钙稳态，导致细胞内应激。因此，HIV Tat与酒精暴露共存可能对星形胶质细胞施加双重应激，导致炎症级联协同激活。尽管越来越多证据表明炎症小体激活参与胶质病理，但连接细胞应激与星形胶质细胞NLRP6信号的上游调控机制仍未知。内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激已成为连接环境和代谢损伤与胶质功能障碍的中心机制。HIV Tat和酒精均已被证明在神经和胶质细胞中诱导未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR），导致钙失调、活性氧产生以及线粒体和溶酶体功能障碍。ER应激通路如PERK、IRE1α和ATF6的持续激活可触发炎症级联并放大促炎细胞因子释放。然而，ER应激是否作为HIV Tat和酒精暴露星形胶质细胞中NLRP6炎症小体激活的上游调节因子尚待阐明。因此，研究人员开展本项研究，假设HIV Tat和酒精协同诱导ER应激，进而触发NLRP6激活、星形胶质细胞反应性和促炎细胞因子释放。据研究人员所知，这是首次在HIV和酒精共暴露期间描绘星形胶质细胞ER应激-NLRP6炎症小体信号轴。阐明该通路为合并AUD个体的NeuroHIV神经免疫病理提供新机制见解，并确定ER应激调节作为减轻HIV Tat和酒精诱导神经炎症的有前景治疗策略。

研究人员将小鼠原代星形胶质细胞（mouse primary astrocytes, MPAs）和人A172星形胶质瘤细胞暴露于HIV Tat（50 ng/mL）和乙醇（50 mM），单独或联合，检测星形胶质细胞激活、NLRP6炎症小体信号、促炎细胞因子产生和ER应激反应。使用4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid, 4-PBA）抑制ER应激，siRNA沉默NLRP6定义通路层级。结果显示联合暴露显著增加星形胶质细胞激活、NLRP6表达、caspase-1切割、IL-1β和IL-18产生；共暴露诱导ER应激标志物BiP、ATF6和磷酸化eIF2α；抑制ER应激抑制NLRP6炎症小体激活和星形胶质细胞反应性；NLRP6敲低减弱炎症信号但不影响ER应激标志物，表明ER应激位于NLRP6上游。结论：识别ER应激–NLRP6炎症小体轴作为HIV Tat和乙醇诱导星形胶质细胞神经炎症的潜在机制，为HAND相关酒精神经炎症提供机制见解。意义：为NeuroHIV合并AUD的神经免疫病理提供新机制，并将ER应激调节作为潜在治疗策略。

方法上，研究人员采用MPAs（分离自出生后0–3天C57BL/6小鼠皮质）和人A172星形胶质瘤细胞（ATCC CRL-1620）。细胞暴露于HIV Tat（50 ng/mL）和/或乙醇（50 mM）。关键方法包括：western blotting检测GFAP、NLRP6炎症小体信号、caspase-1切割、IL-1β、IL-18及ER应激标志物BiP、p-eIF2α、ATF6；免疫细胞化学检测NLRP6与GFAP共定位；RT-qPCR检测Il1β和Il18 mRNA，采用2^?ΔΔCT法归一化至Gapdh；ELISA检测上清IL-1β和IL-18；用4-PBA抑制ER应激，用siRNA沉默NLRP6；统计学采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Sidak多重比较。样本来源为小鼠原代细胞和人A172细胞系，无人类队列。

研究结果：
3.1 乙醇增强HIV Tat诱导的星形胶质细胞NLRP6炎症小体激活。研究人员先验证原代星形胶质细胞纯度，GFAP阳性>97%，IBA1和MAP2未检测到。基于既往研究选择50 ng/mL HIV Tat和50 mM乙醇。MPAs单独或联合处理24 h。Western blot显示联合处理显著增加GFAP和NLRP6，免疫荧光证实NLRP6与GFAP共定位增强。联合暴露增加cleaved caspase-1（p20）、Il1β和Il18 mRNA以及蛋白，ELISA证实上清IL-1β和IL-18升高。人A172细胞中也验证了联合暴露增加GFAP、NLRP6、cleaved caspase-1（p20）、IL-1β和IL-18。结论：乙醇增强HIV Tat诱导的星形胶质细胞NLRP6炎症小体激活和促炎细胞因子释放。
3.2 HIV Tat与乙醇协同诱导星形胶质细胞ER应激。研究人员检测ER应激，联合暴露较单独暴露显著增加BiP/GRP78、p-eIF2α和ATF6在MPAs和A172中。4-PBA（25 μM，暴露前1 h）预处理减弱BiP、p-eIF2α和ATF6诱导，证实HIV Tat和乙醇协同激活ER应激通路。
3.3 ER应激上调HIV Tat和乙醇诱导的星形胶质细胞NLRP6炎症小体激活。4-PBA预处理显著抑制NLRP6蛋白上调、cleaved caspase-1、Il1β和Il18 mRNA、成熟IL-1β和IL-18蛋白，并降低GFAP。免疫染色显示4-PBA减轻NLRP6与GFAP表达和共定位。NLRP6 siRNA敲低有效降低NLRP6，但不改变BiP、p-eIF2α、ATF6水平。结论：ER应激作为上游调节因子，其抑制减弱HIV Tat和乙醇诱导炎症反应。
3.4 NLRP6敲低减弱HIV Tat和乙醇介导的炎症小体激活与细胞因子释放。siRNA沉默NLRP6显著降低cleaved caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA和蛋白，并降低GFAP。结论：NLRP6是HIV Tat和乙醇诱导星形胶质细胞炎症小体激活和促炎细胞因子释放的关键介质。总体结果揭示HIV Tat和乙醇协同激活ER应激和NLRP6炎症小体信号，导致caspase-1切割和促炎细胞因子释放；4-PBA抑制信号，NLRP6敲低减少炎症小体激活和星形胶质细胞反应性；ER应激是NLRP6介导神经炎症的上游调节因子。

讨论部分总结：本研究确定新信号轴：HIV Tat和乙醇协同诱导ER应激并激活星形胶质细胞NLRP6炎症小体，导致促炎细胞因子释放和星形胶质细胞反应性。该ER应激-NLRP6炎症小体信号通路是NeuroHIV和AUD背景下神经炎症的先前未表征机制。药理学抑制ER应激抑制炎症小体激活和促炎细胞因子产生，NLRP6敲低减弱下游炎症反应，建立ER应激为上游调节因子。ER应激是由蛋白折叠、钙稳态和氧化还原平衡扰动触发的细胞适应机制；持续时启动UPR，通过PERK、IRE1α、ATF6恢复蛋白稳态或促进炎症和细胞死亡。HIV Tat和乙醇均可通过氧化和代谢应激破坏ER稳态。AUD中乙醇暴露与星形胶质细胞ER应激相关，甚至通过IRF3、STING、GRP78影响药物渴求网络。研究人员结果与这些报道一致：HIV Tat和乙醇共暴露协同升高BiP/GRP78、p-eIF2α和ATF6。所用浓度与HIV相关神经炎症和酒精暴露体外模型一致：HIV Tat 10–100 ng/mL可诱导胶质细胞炎症和神经毒性；脑脊液（CSF）中联合抗逆转录病毒治疗（cART）个体可检测到约5–35 ng/mL细胞外Tat；乙醇25–100 mM广泛用于模拟中重度酒精暴露。病毒和毒理学应激源汇合可能压倒星形胶质细胞蛋白稳态，放大炎症反应，导致PLWH合并酒精使用神经病理结局。CNS炎症小体激活广泛归因于NLRP3复合物，本研究强调NLRP6在星形胶质细胞固有免疫信号中的新兴作用。NLRP6最初在肠上皮细胞中表征，调节微生物稳态和无菌性炎症，最近在神经退行性和物质诱导应激条件下胶质群体中被认识。研究人员既往研究显示乙醇暴露上调人原代星形胶质细胞NLRP6信号介质，包括caspase-1、IL-1β、IL-18，并鉴定miR-339为NLRP6负调节因子。本研究数据表明HIV Tat和乙醇暴露后星形胶质细胞NLRP6上调，伴随caspase-1激活和IL-1β、IL-18释放增加。药理学抑制ER应激和siRNA介导NLRP6沉默均消除这些反应，定义ER应激先于炎症小体激活的机制层级。NLRP6敲低后ER应激标志物持续存在，进一步确认ER扰动作用于炎症小体信号上游。另一项关于甲基苯丙胺暴露的研究也证明NLRP6介导星形胶质细胞焦亡和促炎反应的中心作用，突显NLRP6在物质诱导神经炎症中的更广泛相关性。这些发现与先前研究一致：慢性ER应激可通过线粒体功能障碍、活性氧（ROS）积累、钙失调和半通道介导ATP释放触发炎症小体激活。例如乙醇暴露星形胶质细胞中连接蛋白43（Cx43）和泛连接蛋白1（Panx1）半通道促进线粒体超氧化物产生和星形胶质细胞功能障碍，与炎症通路连接。星形胶质细胞中UPR可能通过ATF6和CHOP促进炎症基因转录，从而预备炎症小体成分并促进细胞因子成熟。研究人员结果提示在HIV Tat和乙醇暴露背景下，过度ER应激作为细胞蛋白稳态失败和固有免疫激活之间的分子桥梁。该机制扩展了对星形胶质细胞介导神经炎症的理解，超越经典NLRP3轴，并引入NLRP6作为NeuroHIV和AUD相关胶质病理的新角色。IL-1β和IL-18是炎症小体激活下游效应物，是神经免疫信号关键介质。IL-1β升高与神经元损伤、突触功能障碍和血脑屏障破坏有关。本研究中HIV Tat和乙醇共暴露显著增加促炎细胞因子转录和蛋白水平，强化星形胶质细胞促炎状态。考虑到星形胶质细胞-微胶质细胞串扰的新兴文献，数据可能反映星形胶质细胞启动的炎症级联可放大微胶质细胞反应。鉴于IL-1β和IL-18在促进神经元毒性和认知障碍中的作用，ER应激-NLRP6炎症小体信号轴持续激活可能构成HIV感染和酒精滥用共病个体的神经病理进展。除星形胶质细胞外，NLRP6与全身炎症和肠-脑轴调节更广泛相关。既往研究显示NLRP6缺陷改变肠道微生物组成并增加炎症损伤易感性。考虑到肠和CNS双向通讯以及HIV和酒精对肠道通透性和微生物易位的影响，NLRP6可能作为连接外周和中枢免疫反应的分子导管。鉴于近期发现酒精暴露通过嘌呤能P2X7受体和细胞外囊泡信号损害血脑屏障并触发神经炎症，NLRP6等炎症小体连接肠-脑和胶质通路的作用值得未来研究。从机制角度，研究人员发现ER应激是星形胶质细胞NLRP6炎症小体激活的上游调节因子。虽然4-PBA药理学减弱支持这一关系，但不能区分单个UPR分支（PERK、IRE1或ATF6）的相对贡献。因此，尽管ER应激调节可能是减轻星形胶质细胞驱动炎症的潜在策略，需要通路特异性方法进一步研究明确精确信号机制。靶向调节NLRP6也可能提供调节炎症小体驱动神经炎症反应的补充方法。其他局限：研究使用MPAs和人A172星形胶质瘤细胞系，可能无法完全再现人原代星形胶质细胞反应复杂性。NLRP6在多个物种中进化保守，包括小鼠、大鼠、非人灵长类和人类，支持该通路更广泛生物学相关性。未来使用人诱导多能干细胞（iPSC）衍生星形胶质细胞或死后脑组织以及体内模型将必要建立生理相关性。研究结论部分翻译：总之，研究人员的研究证明HIV Tat和乙醇协同诱导星形胶质细胞内质网应激依赖性NLRP6炎症小体激活，导致IL-1β和IL-18产生增加并促进神经炎症反应。这些发现定义了一个ER应激-NLRP6信号轴，作为连接HIV Tat和乙醇暴露与星形胶质细胞功能障碍的潜在机制，为物质使用背景下的NeuroHIV提供了机制见解。