《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Hyperglycemia-Induced Microglial CTSS Disrupts Blood-Retinal Barrier Integrity via PAR2-Dependent Downregulation of Endothelial MFSD2A
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背景：糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病导致失明的主要原因，涉及神经免疫串扰失调。虽然小胶质细胞活化和内皮功能障碍在DR中已确立，但连接先天免疫与血-视网膜屏障（BRB）破坏的分子机制仍不明确。
方法：研究人员结合糖尿病小鼠视网膜的单细胞RNA测序（scRNA
背景：糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病导致失明的主要原因，涉及神经免疫串扰失调。虽然小胶质细胞活化和内皮功能障碍在DR中已确立，但连接先天免疫与血-视网膜屏障（BRB）破坏的分子机制仍不明确。
方法：研究人员结合糖尿病小鼠视网膜的单细胞RNA测序（scRNA-seq）与体内模型、视网膜内皮主要促进因子超家族结构域包含蛋白2a（MFSD2A）过表达以及通过腺相关病毒（AAV）介导的小胶质细胞组织蛋白酶S（CTSS）敲低。人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）和人小胶质细胞（HMC3）接受高糖条件，并结合体外系统（Transwell共培养、全息三维层析）。机制研究采用小干扰RNA（siRNA）敲低、质粒过表达、外源性CTSS补充和转胞吞实验。
结果：scRNA-seq显示糖尿病诱导视网膜小胶质细胞中CTSS上调（p = 0.0031）和内皮细胞中MFSD2A下调（p = 0.01）。小胶质细胞CTSS促进M1极化（p < 0.001）和促炎细胞因子分泌（IL-1β和TNF-α，p < 0.05），而Ctss敲低减弱这些效应（p < 0.05）。CTSS激活内皮蛋白酶激活受体2（PAR2），抑制内皮MFSD2A并增强小窝蛋白-1（caveolin-1）介导的转胞吞。内皮MFSD2A过表达降低血管通透性，且独立于紧密连接调控（ZO-1、Occludin、Claudin-5，p > 0.05）。糖尿病中小胶质细胞-内皮细胞串扰被破坏，超微结构改变（胞质皱缩、小胶质细胞阿米巴样转化）促进细胞毒性相互作用并加剧血管内皮损伤。
结论：高血糖诱导视网膜小胶质细胞活化和CTSS上调，通过PAR2通路破坏小胶质细胞-内皮细胞串扰，抑制内皮MFSD2A表达，增强转胞吞，损害内血-视网膜屏障（iBRB）完整性，并加速DR进展。靶向小胶质细胞CTSS或内皮MFSD2A的治疗策略是保护糖尿病患者视力的有前景途径。
糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病常见微血管并发症，也是工作年龄人群可预防视力丧失和失明的主要原因。其全球疾病负担预计到2045年显著增加。DR发病涉及遗传易感性、代谢失调和炎症级联的复杂交互。视网膜先天免疫细胞，尤其是小胶质细胞，作为视网膜免疫炎症平衡的关键调节者，在糖尿病条件下异常活化，并通过与小胶质细胞-血管内皮细胞的不良串扰触发内皮功能障碍。血-视网膜屏障（BRB）是隔离视网膜组织与全身循环并维持免疫豁免的结构功能屏障。BRB完整性高度依赖受调控的转胞吞（transcytosis，囊泡介导的跨内皮运输），而主要促进因子超家族结构域包含蛋白2a（MFSD2A）是富集于微血管内皮细胞的转胞吞抑制因子，通过抑制小窝蛋白（CAV）依赖通路维持BRB稳定。糖尿病视网膜中MFSD2A
+内皮群体减少，同时小胶质细胞炎症基因上调，提示先天免疫活化与血管渗漏之间存在机制联系。然而，介导小胶质细胞-内皮细胞通讯并影响MFSD2A介导通透性的分子驱动因素仍不清楚。组织蛋白酶S（CTSS）是一种在炎症性疾病中过表达的溶酶体半胱氨酸蛋白酶，具有免疫调节双重作用。本研究识别糖尿病小胶质细胞中上调的CTSS是视网膜免疫炎症稳态的关键调节因子，并证明高血糖诱导的CTSS通过内皮蛋白酶激活受体2（PAR2）/MFSD2A轴加剧转胞吞，破坏血管完整性，加速从亚临床DR向晚期阶段进展。该研究阐明连接小胶质细胞炎症与内皮功能障碍的CTSS-PAR2-MFSD2A信号级联，为减轻糖尿病视网膜损伤提供潜在治疗靶点。
主要关键技术方法：样本来源包括雄性C57BL/6J小鼠（Vital River Laboratories，北京）及人源HRMECs（iCell，上海）、HMC3（Procell，武汉）。研究人员采用链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病小鼠模型、视网膜scRNA-seq、玻璃体腔注射AAV介导内皮MFSD2A过表达和小胶质细胞CTSS敲低、高糖细胞模型、Transwell共培养、全息三维层析、siRNA/质粒干预、转胞吞实验、免疫荧光与免疫组化、透射电镜、FITC-dextran渗漏、流式细胞术、ELISA、Western blot、qRT-PCR、CCK-8及CellPhoneDB分析等。
研究结果：
3.1 单细胞转录组图谱：研究人员通过STZ诱导建立糖尿病小鼠模型，发现DR组出现持续高血糖、体重下降和胰岛素水平降低，视网膜基底膜增厚、血管渗漏增加，并伴空泡变性和细胞结构破坏。scRNA-seq从Control和DR视网膜分别获得14,207和13,607个细胞，鉴定出Müller细胞、无长突细胞、双极细胞、视锥细胞、视杆细胞、内皮细胞、壁细胞和单核吞噬细胞（MPs）等八类细胞。MPs富集小胶质细胞标志物P2ry12、Cx3cr1、C1qc，且小胶质细胞占视网膜免疫细胞90%以上。研究人员据此将MPs作为小胶质细胞分析，提示早期糖尿病视网膜代谢紊乱可诱导免疫炎症失衡并加重神经血管损伤。
3.2 糖尿病诱导的代谢失调触发活化视网膜小胶质细胞中CTSS表达：scRNA-seq显示CTSS主要表达于视网膜小胶质细胞。研究人员基于既往scRNA-seq数据发现糖尿病显著升高视网膜小胶质细胞Ctss mRNA表达（log2FC = 0.4952，p = 0.0003），免疫荧光定量验证糖尿病诱导活化视网膜小胶质细胞中CTSS上调（p = 0.0119）。Control视网膜小胶质细胞呈分支状，DR视网膜中转变为胞体增大、突起截短的阿米巴样细胞，提示小胶质细胞活化、形态重塑和重分布。
3.3 CTSS驱动糖尿病视网膜病变中小胶质细胞促炎极化：研究人员通过GSEA、组织病理染色和Western blot验证糖尿病小鼠视网膜小胶质细胞CTSS敲低模型。高糖不影响小胶质细胞活力，但增加M1表型比例，上调IL-1β和TNF-α，降低IL-10和TGF-β，不影响M2表型比例。HG + siCTSS降低M1极化，抑制IL-1β和TNF-α表达，部分恢复IL-10和TGF-β表达。结果表明HG诱导的CTSS过表达驱动小胶质细胞向促炎表型活化，破坏细胞因子平衡，建立促炎微环境；敲低CTSS可抑制该过程。
3.4 早期糖尿病视网膜内皮细胞中MFSD2A下调：研究人员利用scRNA-seq分析发现Mfsd2a主要表达于视网膜内皮细胞，DR组表达降低（p = 0.01）。免疫组化和免疫荧光定量证实DR组全视网膜MFSD2A下调（p = 0.0002），视网膜内皮细胞中MFSD2A亦下调（p = 0.0040）。结果表明MFSD2A在视网膜内皮细胞中组成性表达，糖尿病诱导的MFSD2A抑制发生于早期糖尿病。
3.5 内皮MFSD2A过表达通过抑制转胞吞改善糖尿病血管渗漏：研究人员建立糖尿病小鼠视网膜内皮MFSD2A过表达模型。TEM显示Control组视网膜结构紧密，线粒体完整，血管基底膜薄，转胞吞少；DR组线粒体空泡化、基底膜增厚、胞质空泡变性、转胞吞增加。MFSD2A-NC与DR病理相似；MFSD2A-OE部分恢复基底膜厚度，减少转胞吞，改善内皮细胞结构。FITC-dextran检测显示DR组血管渗漏显著，MFSD2A-OE明显减少荧光外渗但仍有残留。结果表明糖尿病诱导的MFSD2A下调驱动视网膜血管高通透，内皮MFSD2A过表达可通过抑制转胞吞部分恢复屏障功能。
3.6 MFSD2A通过转胞吞依赖机制独立于紧密连接调控血管通透性：在HRMECs中，高糖抑制内皮Mfsd2a mRNA和蛋白表达，HRP通透性实验显示高糖使HRP渗漏增加51%。MFSD2A-OE恢复MFSD2A表达，并使高糖诱导的渗漏减少50%。高糖上调CAV-1表达，MFSD2A-OE逆转高糖诱导的CAV-1升高。紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5未见显著变化。结果表明MFSD2A通过CAV-1依赖的转胞吞机制调控血管通透性，独立于经典紧密连接蛋白动态。
3.7 CTSS-PAR2介导小胶质细胞-内皮细胞串扰并调控内皮MFSD2A表达：研究人员通过CellPhoneDB配体-受体互作分析、全息三维层析和2D共培养发现，正常葡萄糖下小胶质细胞与内皮细胞呈共生互动；高糖下出现动态突起伸展-回缩，小胶质细胞突起先主动接触内皮细胞，诱导内皮凋亡后快速回缩，提示高血糖破坏生理性小胶质细胞-内皮细胞通讯，促进细胞毒性相互作用和血管损伤。外源性CTSS增强高糖诱导的MFSD2A抑制，PAR2 siRNA消除CTSS介导的MFSD2A抑制。研究人员进一步排除内皮自分泌CTSS对PAR2的激活作用。Transwell共培养中，高糖诱导HRMECs MFSD2A抑制，小胶质细胞CTSS敲低或内皮PAR2敲低均上调MFSD2A表达，但均未完全恢复至正常水平。结果表明CTSS-PAR2信号轴调控小胶质细胞-内皮细胞通讯中的内皮MFSD2A表达，糖尿病条件下可能还存在其他MFSD2A调节机制。
讨论部分指出，DR是糖尿病主要微血管并发症，全球患病率高，亟需阐明发病机制和识别新治疗靶点。早期DR中免疫失调先于明显血管异常，小胶质细胞作为视网膜固有免疫哨兵，其活化先于大胶质细胞反应，是视网膜炎症的早期介质。研究人员证明早期糖尿病模型中视网膜小胶质细胞形态活化和重分布，与iBRB初始损伤中的作用一致；Mills et al.证实糖尿病视网膜fractalkine-CX3CR1轴活化驱动小胶质细胞-内皮细胞相互作用并诱导毛细血管收缩。CTSS作为关键炎症介质，调控小胶质细胞极化，研究人员通过scRNA-seq和CTSS敲低证明糖尿病驱动M1促炎极化并增加TNF-α和IL-1β表达，但未检测到其他外周免疫细胞明显视网膜浸润。PAR2-MFSD2A轴在内皮功能障碍中发挥作用，CTSS通过细胞外切割激活内皮PAR2，共培养显示小胶质细胞CTSS通过PAR2抑制内皮MFSD2A，但CTSS或PAR2敲低均未完全恢复MFSD2A至正常水平。Kumar在糖尿病肾病中证实CTSS-PAR2抑制改善血管结局，Sayed报道高糖诱导HUVECs中CTSS上调，而本研究中HRMECs在正常或高糖条件下CTSS表达可忽略，差异可能源于细胞类型特异性反应和方法学差异。MFSD2A被视为血管完整性守门员，BRB破坏标志DR从临床前向临床转变。内皮屏障通透性可由转胞吞动态调节，CAV介导的转胞吞起关键作用；MFSD2A是微血管内皮特异性转胞吞抑制因子，其下调驱动高通透。MFSD2A过表达部分恢复CAV-1介导的转胞吞而不影响紧密连接蛋白，Wang et al.也强调MFSD2A通过caveolin调节维持iBRB。MFSD2A转运与溶血磷脂酰胆碱结合的脂质进入视网膜，对维持神经功能和血管通透性至关重要。基于此，研究人员提出两种中枢神经系统药物递送策略：可逆抑制内皮MFSD2A可增强大分子治疗药物向视网膜的转胞吞效率；靶向开发与溶血磷脂酰胆碱偶联的小分子药物可增加其与内皮MFSD2A亲和力，从而提高跨越iBRB的药物递送效率。MFSD2A介导的转胞吞是视网膜药物开发和增强药物生物利用度的有前景治疗靶点。
研究结论：高血糖诱导视网膜小胶质细胞活化和CTSS上调，通过PAR2通路破坏小胶质细胞-内皮细胞串扰，抑制内皮MFSD2A表达，增强转胞吞，损害iBRB完整性，并加速DR进展。靶向小胶质细胞CTSS或内皮MFSD2A的治疗策略是保护糖尿病患者视力的有前景途径。
