地中海饮食依从性与健康男性精子DNA甲基化差异的关联：Led-Fertyl研究

《Andrology》：Differential Sperm DNA Methylation Profiles in Healthy Men With High Versus Low Adherence to the Mediterranean Diet in the Led-Fertyl Study

摘要 背景 已知饮食不仅在精子质量中发挥重要作用，还可能通过精子表观基因组影响后代健康。此外，地中海饮食（MedDiet）的主要成分之一（即坚果）已被证明可影响精子DNA甲基化模式。 目的 本研究旨在探讨健康男性中地中海饮食依从性与精子DNA甲基化模式之间的关联。 材料与方法 本横断面研究从参与“生活方式与环境决定因素对精液分析及其他男性生育相关参数”（Led-Fertyl）研究的200名受试者中，基于地中海饮食依从性水平（高依从性 vs. 低依从性）随机选取了60名育龄期（18–40岁）健康男性。收集了详细的饮食与生活方式信息及精液样本。提取精子DNA后进行亚硫酸氢盐转化，随后根据既定方案杂交至Infinium MethylationEPIC v2.0芯片。使用R统计软件分析精子DNA甲基化，当高依从性与低依从性组间的平均甲基化差异绝对值≥0.10且校正后p值<0.05时，认为CpG位点存在差异甲基化。 结果 高依从性与低依从性两组参与者在一般特征和人体测量指标方面无显著差异。监督性差异甲基化分析发现，在校正年龄、吸烟状况和体重指数（BMI）后，与低依从性参与者相比，高依从性参与者（n=30）中存在42个显著差异甲基化的CpG位点，其中17个为高甲基化，25个为低甲基化。对差异甲基化位点涉及的基因进行基因本体论（GO）分析发现，12个GO条目显著富集（校正后p值<0.05），主要涉及环核苷酸信号传导、离子通道活性、膜运输/内吞作用、细胞骨架组织和转录调控。 讨论 这些新颖而初步的研究结果表明，饮食质量与精子表观基因组之间可能存在关联。未来应在更大、更多样化的人群（包括老年男性和特定个体）中进行研究，以验证这些观察结果。 结论 总体而言，研究人员的发现表明，坚持富含天然甲基供体和辅因子的地中海饮食模式，可能调节特定基因组位点的精子DNA甲基化。

论文解读：地中海饮食依从性与健康男性精子DNA甲基化差异的关联——来自Led-Fertyl研究的证据

一、研究背景与科学问题

近年来，饮食模式对男性生殖健康的影响日益受到关注。地中海饮食（MedDiet）作为一种公认的健康膳食模式，以高摄入水果、蔬菜、豆类、坚果、橄榄油和全谷物，适量摄入禽肉、鱼类和红酒，以及限制红肉、加工肉类和甜食为特征，已被证实与多种慢性疾病的风险降低相关。在男性生育领域，已有横断面研究和随机对照试验表明，坚持地中海饮食与改善精子质量参数呈正相关，并可提升睾酮水平、减少精子DNA碎片化。然而，传统精液参数之外，饮食是否通过表观遗传机制（特别是精子DNA甲基化）影响男性生育力，尚缺乏深入探索。既往动物实验显示，叶酸缺乏可通过改变精子甲基化模式导致子代出生缺陷，而人类研究中单独补充叶酸或锌+叶酸均未观察到精子DNA甲基组的显著变化。值得注意的是，一项随机对照试验发现，在西式饮食基础上添加坚果（地中海饮食的核心组分）可微妙地影响36个基因组区域的精子DNA甲基化。鉴于坚果是地中海饮食的关键组成部分，这一发现提示整体地中海饮食依从性可能更广泛地影响精子DNA甲基化谱。因此，本研究旨在系统评估健康男性中地中海饮食依从性与精子DNA甲基化模式之间的关联。

二、研究方法概述

本研究为横断面设计，研究对象来源于Led-Fertyl（Lifestyle and Environmental Determinants of Seminogram and Other Male Fertility-Related Parameters）研究。研究人员从首批200名参与者中，根据地中海饮食依从性水平（采用已验证的14分MEDAS评分工具评估）随机选取60名健康育龄期男性（18–40岁），分为高依从性组（MEDAS评分≥10分，n=30）和低依从性组（MEDAS评分<7分，n=30）。所有参与者完成生活方式、社会人口学和医疗信息问卷，并在禁食状态下采集血液、精液及人体测量数据。膳食摄入通过已验证的143项半定量食物频率问卷评估。精液分析遵循世界卫生组织（WHO）2021年指南，使用计算机辅助精子分析（CASA）系统。精子DNA提取后进行亚硫酸氢盐转化，采用Infinium MethylationEPIC v2.0 BeadChip进行全基因组DNA甲基化分析，该平台可检测超过935,000个CpG位点。甲基化数据分析使用R软件中的Minfi包，经Noob法归一化后，先通过生物学筛选（两组平均甲基化差异绝对值≥0.10）识别差异甲基化位点（DMPs），再经回归分析校正技术批次效应、芯片位置及年龄、吸烟状态、BMI等协变量，最终以校正后p值<0.05定义显著差异甲基化位点。基因本体论（GO）富集分析通过EnrichR工具完成。

三、主要研究结果

3.1 质量控制

质量控制结果显示，样本呈现预期的双峰甲基化分布模式，高依从性与低依从性两组间无明显分离。通过DLK1位点的甲基化分析确认样本无体细胞污染。

3.2 差异甲基化分析

监督性单CpG位点甲基化分析首先筛选出147个符合生物学阈值（平均甲基化差异绝对值≥0.10）的差异甲基化位点（DMPs），其中66个在高依从性组中呈高甲基化，81个呈低甲基化。进一步回归分析校正协变量后，共鉴定出42个显著差异甲基化的CpG位点（校正后p值<0.05），包括17个高甲基化和25个低甲基化位点。层次聚类分析显示，这些位点可将样本分为两个主要簇，其中簇2主要由高依从性参与者组成，簇1主要由低依从性参与者组成（Fisher检验p<0.001）。基因组分布方面，66.67%（n=28）的DMPs位于开放海区（远离CpG岛），64.29%（n=27）位于基因间区，23.81%（n=10）与编码基因重叠。部分DMPs位于启动子相关区域（如TSS1500和5′UTR），提示潜在的调控意义。GO富集分析显示，与差异甲基化位点相关的基因显著富集于14条功能通路，主要涉及环核苷酸信号传导、离子通道活性、膜运输/内吞作用、细胞骨架组织和转录调控。值得注意的是，多个基因（如CNGB3和CLIP1）已有实验证据支持其在睾丸发育、精子发生、精子形态和生育力中的作用。

四、讨论与结论

讨论总结

这是首次探讨地中海饮食依从性与精子DNA甲基化模式关联的研究。研究发现42个差异甲基化位点，大部分位于基因间区和开放海区，提示饮食相关的表观遗传差异可能涉及远端调控机制，而非直接影响启动子活性。这些结果与先前坚果补充干预试验中发现的36个差异甲基化区域相呼应，进一步支持地中海饮食中的营养成分（如叶酸B9、维生素B6、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸、镁等）可能通过一碳代谢途径影响甲基化过程。研究还指出，吸烟、空气污染物、社会经济地位和衰老等其他环境因素也可能影响精子甲基化，本研究已对吸烟和年龄等因素进行了校正。技术层面，本研究使用的EPIC v2.0阵列相较于早期版本增加了超过20万个探针，覆盖增强子和CTCF结合位点，提供了更广泛的基因组覆盖。研究人员强调，甲基化的高或低不能简单归类为“有益”或“有害”，其功能后果取决于CpG位点的基因组定位和受影响基因的生物学角色。研究局限性包括样本量较小（限制了统计效能和普适性）、横断面设计无法推断因果关系、GO富集分析中每条通路仅由单个基因支持等。优势在于首次揭示地中海饮食与精子甲基化的关联，且同质性高的年轻健康人群减少了混杂因素。

研究结论翻译

总之，研究人员的发现提供了新的证据，表明坚持地中海饮食可能微妙地影响特定CpG位点的精子DNA甲基化。这些结果虽然是探索性的，但提示饮食质量与精子表观遗传景观之间存在潜在联系。未来的研究应旨在更大、更多样化的人群（如老年男性或不育人群）中重复这些结果，并通过随机对照试验建立因果关系。理解精子甲基化的营养和分子决定因素，可为饮食在男性生殖健康中的作用提供新的见解。