特定模式突变对登革病毒3型（DENV3）空斑形成及减毒特性的影响：结构蛋白与非结构蛋白突变的组合作用

《Advances in Virology》：Impact of Specific Pattern Mutations on Plaque Formation and Attenuation Properties of Dengue Virus Serotype 3

　　

登革热（dengue fever）在包括泰国在内的多个国家是重大公共卫生问题。开发针对全部四种血清型的有效登革疫苗对于控制该疾病很重要。减毒登革3型疫苗候选株DENV3-MBU-1是基于原型DENV3疫苗候选株序列的全长cDNA（complementary DNA）组装片段衍生而来；该原型株来源于DENV3 16562株，在primary green monkey kidney（PGMK）细胞中传代30次，并在primary dog kidney（PDK）细胞中传代4次。与亲本DENV3-16562序列相比，该DENV3-MBU-1在premembrane（prM）、envelope（E）以及nonstructural protein（NS2A、NS3、NS4）中含有七个非同义突变。在本研究中，研究人员旨在通过生成不同DENV3突变体并评估其特性，包括plaque formation和mice neurovirulence，来鉴定促成attenuation的突变。将NS proteins回复为亲本病毒的DENV3-MBU-1突变体表现出改变的表型，表现为plaque size和virulence变化，类似亲本病毒。这提示NS片段在attenuation中的重要作用。有趣的是，仅structural proteins改变而NS proteins未改变的DENV3-MBU-1突变体，其表型向plaque增大和neurovirulence增强变化。这提示attenuation可能受特定突变组合而非单点突变影响。这些发现以及所生成的attenuated DENV3 viruses为登革疫苗开发提供了有用信息。

登革病毒（dengue virus, DENV）属于Orthoflavivirus属、Flaviviridae科，有DENV1、DENV2、DENV3和DENV4四种血清型。登革感染可导致从非分化发热、登革热到登革出血热（dengue hemorrhagic fever, DHF）和登革休克综合征（dengue shock syndrome, DSS）等临床谱。疫苗开发困难，原因之一是异型交叉反应抗体可能通过Fcγ受体促进病毒进入并增加复制，即抗体依赖性增强（antibody-dependent enhancement, ADE），因此需要诱导针对四种血清型的平衡保护。已有CYD-TDV（Dengvaxia?, Sanofi Pasteur）和TAK-003（Qdenga?, Takeda）等减毒活疫苗（live attenuated vaccine, LAV），但其保护范围和血清型差异仍提示需要继续改良登革疫苗。泰国Mahidol大学开发的DENV3疫苗原型16562经primary green monkey kidney（PGMK）细胞传代30次、primary dog kidney（PDK）细胞传代4次形成PGMK30/PDK4，表现小空斑和乳鼠低神经毒力，并作为KD-382（KM Biologics）四价疫苗组分推进；非人灵长类和I期临床试验显示其免疫原性和安全性。由该原型通过RT-PCR扩增片段组装获得的DENV3-MBU-1保留减毒表型，但其减毒分子标记尚未明确。因此，研究人员通过反向遗传学生成突变病毒，旨在鉴定DENV3-MBU-1中与减毒相关的特定突变及其组合。

研究人员开展的工作是：比较DENV3-MBU-1与亲本DENV3-16562的基因组序列，确认七个非同义突变；利用反向遗传学将这些突变回复为亲本序列或构建不同组合突变体；通过空斑试验、乳鼠神经毒力试验、THP-1细胞复制动力学、干扰素（interferon, IFN）反应基因表达、双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）免疫荧光和分子对接分析评估其表型。研究结论是：NS蛋白突变在维持减毒表型中具有关键作用，EDIII及结构蛋白突变也参与表型调控；减毒更可能由特定突变模式而非单点突变决定。其意义在于为DENV LAV疫苗开发提供减毒分子标记和候选病毒信息。

关键技术方法概括：研究人员采用RT-PCR扩增DENV3基因组片段，以pDENV3-ΔFL为模板引入目标突变，通过亚基因组片段组装并在Vero:HEK-293T共培养细胞中转染回收病毒，经全基因组测序确认。表型分析包括LLC-MK₂细胞空斑试验、2日龄ICR小鼠（Nomura Siam International, Thailand）颅内接种1000 pfu/鼠的神经毒力试验、THP-1细胞感染复数（multiplicity of infection, MOI）2复制动力学、RT-qPCR检测3^′UTR病毒RNA及IFN-α、OAS表达、免疫荧光检测dsRNA，以及DENV3 E与DC-SIGN复合物结构的分子对接。细胞系来源ATCC；无人类队列。

结果部分如下。

3.1. 基因组序列比较显示DENV3-MBU-1与亲本DENV3株之间存在七个非同义突变。通过比较DENV3-MBU-1与亲本DENV3-16562的完整基因组序列，研究人员发现12个核苷酸替换，其中5个为同义突变，7个为非 synonymous突变，即A719T、A1838G、G1913A、G2106A、T3725C、C4781A和G6572A，位于prM、E、NS2A、NS3和NS4A；对应prM-95、E-302、E-327、E-392、NS2A-86、NS3-90和NS4A-68。结论是这些突变是候选减毒决定簇。

3.2. 生成携带单个及多个已鉴定突变的DENV3。研究人员首先尝试构建含CMV启动子和BGH终止序列的全长DENV3感染性cDNA，但因NS1基因第2472位核苷酸缺失而未能获得完整基因组，得到pDENV3-ΔFL；随后改用感染性亚基因组扩增子组装策略，生成14个突变病毒，包括NS-MBU-1、S-MBU-1、MBU-1-1.1m至MBU-1-1.7m及多种组合突变体；MBU-1-1.3m和MBU-1-1.5m未能产生；成功回收病毒经全基因组测序确认。通过该反向遗传学流程，研究人员获得了用于表型分析的突变病毒库。

3.3. 突变病毒的特征。通过空斑试验比较，S-MBU-1形成显著大于亲本DENV3-16562的空斑，平均2.09±0.42 mm；NS-MBU-1形成较小空斑，平均0.88±0.19 mm，与DENV3-MBU-1相近。单NS回复突变体MBU-1-1.6m和MBU-1-1.7m空斑分别为1.38±0.40 mm和1.32±0.26 mm，与亲本1.13±0.29 mm无显著差异；NS2A单回复突变体无法救获。结构蛋白单突变中，MBU-1-1.1m空斑小，平均0.66±0.10 mm，类似DENV3-MBU-1；MBU-1-1.2m显著增大至2.09±0.42 mm；MBU-1-1.4m呈增大趋势但无统计学意义；MBU-1-34m双突变显著增大至1.43±0.25 mm。组合结构及NS突变均导致空斑增大。结论是减毒受特定突变组合影响，NS蛋白关键，结构蛋白突变也影响病毒复制和空斑形成。

3.4. NS-MBU-1在乳鼠中神经毒力显著降低。通过2日龄ICR小鼠颅内接种1000 pfu/鼠并观察21天，NSS组全部存活；亲本DENV3-16562组存活率73.91%，平均存活时间（average survival time, AST）19.04±0.72天；DENV3-MBU-1组存活率93.75%，AST 20.38±0.44天；S-MBU-1组存活率34.48%，AST 17.31±0.60天，神经毒力显著高于亲本；NS-MBU-1组存活率96.67%，AST 20.73±0.27天，类似DENV3-MBU-1；MBU-1-1.6m和MBU-1-1.7m存活率分别为67.86%和70.00%，接近亲本。结论是NS蛋白对低神经毒力关键，NS3和NS4A突变均对减毒重要。

3.5. DENV3-MBU-1和NS-MBU-1在THP-1细胞中复制较低并激活高于亲本DENV3-16562的IFN反应。通过THP-1细胞MOI 2感染及复制动力学检测，DENV3-MBU-1和NS-MBU-1复制低于亲本，峰值在第2天，随后逐渐下降。RT-qPCR显示，DENV3-MBU-1感染显著增加IFNα和OAS表达，NS-MBU-1感染增加OAS但不增加IFNα。免疫荧光检测dsRNA分布未见明显差异；靶向3^′UTR的RT-qPCR显示，仅DENV3-MBU-1病毒RNA显著低于亲本和NS-MBU-1，NS-MBU-1与亲本无显著差异。结论是DENV3-MBU-1减毒与较高IFN-α反应及较低病毒RNA相关，NS-MBU-1的减毒机制可能不同。

3.6. DENV3-MBU-1和NS-MBU-1的减毒表型似乎不依赖于直接破坏DC-SIGN结合位点。通过基于DENV3 E同源二聚体与DC-SIGN碳水化合物识别域复合物晶体结构的分子对接和结构分析，E-302和E-327位于包膜蛋白表面，E-392相对较少暴露，但这些残基均未与预测的DC-SIGN结合位点重叠。结论是这些突变导致的减毒表型不太可能源于直接破坏DC-SIGN结合位点；β₃ integrin和糖胺聚糖（glycosaminoglycans, GAGs）因缺乏合适结构模型未能在本研究中评估。

讨论部分总结：LAV可通过在非自然宿主细胞中连续传代获得，也可在已知减毒标记时通过反向遗传学生成。DENV3-MBU-1由DENV3-16562经PGMK和PDK传代后的片段组装而来，体外和体内均显示小空斑和低神经毒力。研究人员在构建全长感染性cDNA时遇到黄病毒序列在Escherichia coli中不稳定这一障碍，故采用pDENV3-ΔFL模板和亚基因组扩增子组装回收病毒。七非同义突变位于prM（L95I）、E（G302S、K327E、R392K）、NS2A（L86F）、NS3（K90Q）和NS4A（T68A）。NS突变回复会增加空斑大小和毒力，S-MBU-1毒力最高；即使EDIII突变回复至亲本，保留NS突变仍维持体内减毒，说明NS蛋白关键。NS3 K90Q位于连接NS3丝氨酸蛋白酶两个亚结构域的linker肽，邻近保守色氨酸W89，不在催化位点；NS4A A68T位于内质网跨膜α螺旋PTMD1；NS2A L86F位于PTMD3，单回复病毒无法救获。分子对接显示这些突变不直接破坏DC-SIGN结合位点，但不能排除间接影响包膜蛋白构象或动力学。与KD-382疫苗种子相比，后者有13个突变，其中4个位于相似位置，包括aa 302、392以及NS2A aa86和NS3 aa90。79个DENV3完整基因组序列比对显示，1838（E-302）、1913（E-327）、3725（NS2A-86）、4781（NS3-90）和6572（NS4A-68）高度保守。突变体激活IFNα和OAS，提示可降低病毒基因组复制效率；Pintado Silva J等关于DENV4 TV003疫苗株的研究支持减毒株可触发先天免疫反应。研究人员认为需进一步研究DENV3-MBU-1和NS-MBU-1诱导先天免疫及促炎反应的程度和体内免疫原性。总体而言，该研究提示特定突变模式而非单点突变影响病毒减毒，为DENV疫苗开发提供信息。

研究结论部分翻译：本研究弥补了鉴定DENV3-MBU-1关键分子标记的空白，为未来LAV登革疫苗开发提供信息。研究人员强调了EDIII和NS蛋白突变作为该疫苗候选株减毒突变的重要性。未来疫苗开发应考虑结构突变和NS突变在病毒减毒中的相互作用。