小白菊内酯靶向Ero1L调控线粒体相关内质网膜稳定性以缓解局限性硬皮病的细胞衰老与纤维化

《Aging Cell》：Targeting Ero1L by Parthenolide Alleviates Cellular Senescence and Fibrosis of Localized Scleroderma by Regulating Mitochondria-Associated Endoplasmic Reticulum Membranes Stabilization

　　

线粒体功能障碍驱动硬皮病的发病机制。线粒体相关内质网膜（mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane, MAM）调控线粒体功能。小白菊内酯（Parthenolide, PTL）对线粒体具有保护作用。然而，其在局限性硬皮病（localized scleroderma, LoS）中的具体作用及机制仍不清楚。本研究探讨了PTL是否通过稳定MAM减轻LoS中的衰老与皮肤纤维化，并考察了合成的温敏缓释水凝胶（F127@PLGA@PTL）对LoS的保护作用。研究人员采用透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）观察LoS皮肤病变中的MAM异常。开展了多项分子生物学实验，以研究PTL在TGF-β诱导的人真皮成纤维细胞（human dermal fibroblasts, HDFs）及LoS小鼠模型中的保护作用。利用RNA测序、基于分子对接的反向虚拟筛选及表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）寻找PTL的可能靶点。采用乳化-挥发法制备负载PTL的PLGA纳米颗粒。在LoS中，MAM的钙离子转运功能增强且其数量增加。PTL可通过调控IP3R1/Grp75/VDAC1复合物并修复线粒体损伤，改善TGF-β诱导的HDF细胞及博来霉素诱导的LoS模型中的衰老与纤维化。值得注意的是，在机制上，这种保护作用是通过抑制Ero1L介导的，其中ARG-449被确定为PTL–Ero1L结合的关键残基。Ero1L过表达逆转了PTL的保护作用。此外，Ero1L敲低在TGF-β诱导的HDFs中也表现出抗衰老和抗纤维化作用。进一步研究表明，F127@PLGA@PTL在小鼠LoS模型中表现出优异的缓释性能和显著的治疗效果。该研究表明，PTL通过调控Ero1L介导的MAM稳定来减轻LoS的纤维化。

论文解读

一、研究背景与科学问题

局限性硬皮病（localized scleroderma, LoS）是一种罕见的慢性结缔组织疾病，以真皮或皮下层的皮肤硬化与纤维化为特征。严重者可伴发皮肤溃疡、毁容性皮损，随病情进展可导致关节畸形、活动严重受限及骨折风险增加，给患者带来巨大的身心负担与经济压力。目前LoS的治疗主要依赖免疫抑制剂和糖皮质激素，尽管托珠单抗和JAK抑制剂等新疗法不断涌现，但尚无任何可用疗法能够逆转LoS的皮肤纤维化。因此，深入理解LoS的分子机制并寻找有效的治疗药物至关重要。

既往研究表明，硬皮病的发病涉及炎症、纤维化和微血管损伤，而线粒体功能障碍是驱动成纤维细胞活化的核心因素之一。线粒体是活性氧（reactive oxygen species, ROS）的主要来源，氧化应激在LoS发病中发挥重要作用。线粒体相关内质网膜（mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane, MAM）是线粒体Ca²⁺生成的关键结构，IP3R1、GRP75和VDAC1在MAM上构成Ca²⁺通道转运复合物。线粒体Ca²⁺内流与线粒体功能障碍、线粒体ROS（mitochondrial ROS, mtROS）升高及细胞衰老密切相关。近年研究证实细胞衰老参与硬皮病发病，衰老细胞通过分泌衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）促进慢性炎症和上皮-间质转化，推动成纤维细胞和巨噬细胞向纤维化表型转化，最终导致纤维化。因此，MAM调控的线粒体钙内流可能成为干预LoS发病的潜在靶点。

小白菊内酯（Parthenolide, PTL）是从小白菊中提取的倍半萜内酯，具有抗炎、抗氧化、促凋亡和抗肿瘤等多种生物活性。半合成修饰的PTL能够降低线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, MMP）并减少mtROS，从而挽救线粒体功能。鉴于PTL可改善线粒体功能，研究人员推测其可能有助于缓解硬皮病。PTL在多种纤维化疾病中表现出抗纤维化作用，成纤维细胞活化是纤维化疾病的共同发病机制。然而，关于PTL对皮肤纤维化中成纤维细胞活化的影响，现有数据十分有限。此外，尽管PTL具有显著的抗氧化活性和线粒体保护作用，但尚无文献记载PTL如何调节MAM的组装或调控内质网-线粒体Ca²⁺流。遗憾的是，PTL的临床应用受限于其水溶性差和生物利用度低。PLGA纳米颗粒可有效克服PTL的溶解度限制，而F127温敏水凝胶具有缓释作用，两者结合为PTL递送提供了可行策略。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员利用博来霉素（bleomycin, BLM）诱导的LoS小鼠模型，研究PTL对皮肤纤维化的抗衰老和抗纤维化功效。通过RNA测序（RNA-Seq）、免疫共沉淀（Co-IP）、透射电子显微镜（TEM）和分子对接分析PTL抗衰老和抗纤维化作用的潜在机制。采用表面等离子体共振（SPR）验证PTL与Ero1L的直接结合。通过siRNA转染和慢病毒过表达验证Ero1L的功能。利用乳化-挥发法制备PTL负载的PLGA纳米颗粒，并结合F127温敏水凝胶构建F127@PLGA@PTL递送系统，通过TEM、扫描电子显微镜（SEM）、流变学测试和高效液相色谱（HPLC）表征其性能。研究还纳入了华西医院2024年2月至8月间30例硬斑病患者的皮肤组织样本及15例色素痣患者正常皮肤作为对照进行免疫组化分析，另收集3例硬斑病患者皮损及3例色素痣患者皮损周围正常皮肤用于TEM分析。小鼠实验经四川大学华西医院伦理委员会批准（批准号2024(1076)）。

三、研究结果

3.1 PTL抑制TGF-β诱导的HDFs细胞衰老和纤维化

CCK-8实验确定5 μM、48小时为PTL理想干预条件。LoS患者皮损中β-半乳糖苷酶、P16、IL-6、IL-1β和TNF-α表达显著升高。PTL可减少TGF-β1诱导的HDFs中β-半乳糖苷酶阳性细胞并增加EdU阳性细胞，下调p21和p16的mRNA及蛋白水平，减少细胞上清中IL-6、IL-1β和TNF-α分泌，同时下调α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和I型胶原（COL1A1）的mRNA表达。达沙替尼联合槲皮素清除衰老细胞可减轻TGF-β诱导的纤维化，提示PTL可能通过调节细胞衰老减轻纤维化。

3.2 PTL调节MAM稳态从而改善线粒体功能

TEM显示LoS患者皮损中线粒体与内质网间距显著减小。PTL处理可减少线粒体与内质网的共定位，增大细胞器间距。PTL给药后MMP升高、ROS水平降低，表明线粒体损伤减轻。

3.3 PTL下调Ero1L

RNA测序鉴定出1111个TGF-β诱导的差异表达基因（DEGs）和290个PTL处理后的DEGs，其中161个为共同DEGs。GO和KEGG富集分析显示伤口愈合、含胶原细胞外基质和内质网腔通路显著富集。通过2600个基因的反向虚拟筛选取Top100与共同DEGs交集，获得Ero1L和PI16两个候选基因。分子对接显示PTL与Ero1L结合能为?7.3 kcal·mol^?1，SPR验证了直接相互作用。关键结合残基ARG-449突变为丙氨酸后消除PTL与Ero1L的结合，而PHE-62A突变无显著影响。PTL降低TGF-β处理细胞中Ero1L的mRNA和蛋白表达。单细胞RNA测序显示Ero1L在活化成纤维细胞中表达高于其他细胞亚群。

3.4 PTL使MAM区域的Ca²⁺转运正常化

GSEA富集分析显示Ero1L富集于细胞器融合和Ca²⁺转运调控信号通路。PTL下调TGF-β1诱导的HDFs中IP3R1、GRP75和VDAC1的mRNA和蛋白水平。免疫共沉淀显示TGF-β1条件下IP3R1与Grp75、GRP75与VDAC1之间的相互作用增强，PTL处理后减弱。流式细胞术显示PTL可改善线粒体钙超载。

3.5 Ero1L过表达在PTL存在下仍加剧HDFs衰老和纤维化

与TGF-β1+OE-Ctrl组相比，PTL处理显著抑制衰老和纤维化相关蛋白表达，但Ero1L过表达逆转了这种抑制，显著增加了这些蛋白的表达水平。

3.6 Ero1L过表达在PTL存在下仍破坏MAM稳态和Ca²⁺转运

流式细胞术显示Ero1L过表达增加ROS水平、降低MMP水平，削弱PTL对线粒体的保护作用。共聚焦显微镜显示Ero1L过表达减弱了PTL对线粒体和内质网共定位的抑制作用。Ero1L过表达还逆转了PTL对线粒体钙和IP3R1-Grp75、GRP75-VDAC1相互作用的抑制作用。

3.7 Ero1L敲低改善纤维化和衰老，恢复MAM稳态并减轻线粒体钙超载

siRNA敲低Ero1L后，纤维化和衰老相关标志物蛋白水平下调，mtROS水平降低、MMP水平升高，线粒体与内质网共定位减少，TEM显示细胞器间距增大，线粒体钙超载减轻，IP3R与GRP75、GRP75与VDAC1之间的结合减弱。

3.8 F127@PLGA@PTL的特性

TEM显示PLGA@PTL呈球形形态，PLGA@PTL纳米颗粒水溶性增强。F127@PLGA@PTL具有可注射性和温敏特性，SEM显示更致密的三维结构。F127@PLGA@PTL表现出更缓慢、更持续的释放且无初始爆发释放。流变学测试显示PLGA@PTL纳米颗粒的掺入对F127水凝胶流变性能无显著影响，且增强了网络抗变形能力。活/死染色和CCK8实验证实了良好的生物相容性。

3.9 F127@PLGA@PTL在体内通过调节MAM稳定减轻纤维化和衰老

博来霉素成功诱导真皮纤维化，PTL和F127@PLGA@PTL均显著减轻小鼠皮肤纤维化。F127@PLGA@PTL显著改善胶原沉积和皮肤纤维化，显著减弱成纤维细胞活化，对血管内皮细胞、角质形成细胞和Th2淋巴细胞无显著影响。F127@PLGA@PTL还降低Ero1L蛋白表达并表现出抗衰老作用。与体外结果一致，PTL减少线粒体-内质网接触，F127@PLGA@PTL处理也显著降低IP3R1与Grp75、Grp75与VDAC1的相互作用水平。

3.10 Ero1L可能是LoS的潜在生物标志物

LoS患者皮肤活检样本中Ero1L表达显著升高，且Ero1L水平与细胞衰老及改良局限性硬皮病皮肤严重程度指数（mLoSSI）呈正相关。

四、讨论与结论

本研究首次证明LoS中存在线粒体与内质网接触异常。PTL在硬皮病中表现出抗衰老和抗纤维化作用，同时帮助调节内质网与线粒体之间的Ca²⁺转运。机制研究表明PTL通过靶向Ero1L调节MAM稳态和Ca²⁺转运，关键残基ARG-449介导PTL-Ero1L相互作用。Ero1L敲低可减轻成纤维细胞活化，其促纤维化机制可能涉及其对COL1A1表达的调控作用。Ero1L在细胞衰老中的作用存在争议，但其可通过影响ROS产生进而影响细胞命运。F127@PLGA@PTL温敏纳米复合水凝胶递送系统实现了PTL的双重缓释，减少了给药频率并增强了治疗可控性。

结论：本研究首次证明PTL通过调控Ero1L介导的MAM稳定有效缓解衰老和皮肤纤维化，确认了PTL治疗衰老和皮肤纤维化的潜力，并为其潜在分子机制提供了新见解。