《Aging Cell》：IGF-1/SLC25A33 Maintains Blood-Labyrinth Barrier Integrity by Suppressing TGF-β/Smad2-Mediated Pericyte Activation in Age-Related Hearing Loss
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年龄相关性听力损失（ARHL）是老年人中常见的感官障碍，然而耳蜗衰老的分子机制仍不完全清楚。尽管胰岛素样生长因子1（IGF-1）已被认为与ARHL相关，但其在血管纹中，特别是在周细胞介导的血-迷路屏障（BLB）调节中的作用尚不明确。研究人员对从年轻和老年小鼠血
年龄相关性听力损失（ARHL）是老年人中常见的感官障碍，然而耳蜗衰老的分子机制仍不完全清楚。尽管胰岛素样生长因子1（IGF-1）已被认为与ARHL相关，但其在血管纹中，特别是在周细胞介导的血-迷路屏障（BLB）调节中的作用尚不明确。研究人员对从年轻和老年小鼠血管纹中经FACS纯化的周细胞进行了转录组分析。使用原代周细胞培养、慢病毒基因调控和AAV介导的体内递送进行了功能研究。通过听性脑干反应（ABR）和畸变产物耳声发射（DPOAE）评估听觉功能。通过qPCR、Western blot、免疫荧光、流式细胞术和透射电子显微镜（TEM）评估分子变化。转录组学揭示老年周细胞中Igf1和Slc25a33显著下调，且TGF-β信号通路富集。IGF-1缺乏在体外抑制SLC25A33表达，导致线粒体ROS（mtROS）积累、TGF-β/Smad2信号激活以及周细胞表型转换，其特征为α-SMA增加和E-cadherin减少。在体内，抑制IGF-1或SLC25A33激活了血管纹中的TGF-β/Smad2信号，破坏了BLB超微结构，并加剧了听力损失。相反，外源性IGF-1或SLC25A33过表达减弱了这些效应并部分恢复了听觉功能。研究结果确定了一个新的IGF-1/SLC25A33–TGF-β/Smad2轴，该轴调节衰老耳蜗中的周细胞活化和BLB完整性。这一通路为ARHL发病机制提供了机制性见解，并突出了在老年人中保护听力的潜在治疗靶点。
论文解读：IGF-1/SLC25A33–TGF-β/Smad2轴在年龄相关性听力损失中调控周细胞活化与血-迷路屏障完整性
一、研究背景与科学问题
年龄相关性听力损失（ARHL），又称老年性耳聋，是老年人中第三大常见慢性疾病，影响近半数老年人。除纯音阈值升高外，ARHL还表现为言语识别能力下降和声源定位障碍，尤其在嘈杂环境中更为显著。未管理的ARHL与社会退缩、抑郁和认知功能下降风险增加相关，最终导致痴呆发生率升高。随着全球人口老龄化加速，ARHL的公共卫生负担预计在未来几十年显著增加。
ARHL的发病和进展在个体间差异很大，提示涉及内在和外在因素的多因素病因学。遗传易感性、噪声暴露、耳毒性药物和代谢应激均可能促成耳蜗衰老。尽管关注度日益增加，驱动年龄相关性耳蜗退化的分子和细胞机制仍不完全清楚。遗传学研究已确定多个与ARHL易感性相关的候选基因，其中胰岛素样生长因子1（IGF-1）已成为听力功能的关键调节因子。IGF-1不仅对内耳胚胎和出生后发育至关重要，而且对外周和中枢通路的听觉稳态终身维持也必不可少。值得注意的是，循环或组织特异性IGF-1水平降低与人类加速听力损失相关，凸显其在ARHL发病机制中的相关性。
在耳蜗内，IGF-1主要在螺旋神经节神经元和血管纹中表达。以往关于IGF-1在听力损失中作用的研究主要集中在神经保护效应及其在减轻氧化应激、线粒体功能障碍和兴奋性毒性中的作用——这些过程驱动毛细胞（HCs）和螺旋神经节神经元（SGNs）的退化。尽管血管纹也是IGF-1表达的主要部位，但其在ARHL中的功能参与受到的关注有限。SLC25A33（又称PNC1）是一种线粒体核苷酸载体，是IGF-1/IGF-1R应答蛋白，可维持线粒体功能。鉴于耳蜗组织的高代谢需求和线粒体密度，研究人员假设年龄相关的IGF-1下调抑制血管纹周细胞中的SLC25A33活性，通过TGF-β/Smad信号促进其向促纤维化、收缩性表型转变。这种周细胞活化将损害血-迷路屏障（BLB）的完整性，引发微血管功能障碍，最终促成耳蜗衰老和ARHL。
二、研究内容与主要结论
本研究证明衰老相关的IGF-1缺乏直接下调周细胞中的SLC25A33，激活TGF-β/Smad通路，驱动周细胞从静止、稳定状态向活化、收缩性肌成纤维细胞样状态表型转换。这导致BLB形态学破坏和耳蜗功能障碍。研究结果揭示了一个新的IGF-1/SLC25A33–TGF-β/Smad轴在周细胞介导的BLB调节中的作用，为ARHL提供了新的机制见解，并确定了在衰老中保护听力的潜在治疗靶点。
三、主要关键技术方法
研究人员使用了多种关键技术方法。动物模型方面，使用SPF级野生型C57BL/6J小鼠，包括年轻（3月龄）和老年（18月龄）雄性和雌性小鼠。细胞实验采用原代耳蜗周细胞培养和永生化人脑血管周细胞（HBVPs）。转录组分析采用FACS纯化周细胞的Smart-seq2测序。功能研究使用慢病毒基因调控（LV-Slc25a33-OE和LV-Slc25a33-shRNA）和AAV-ie载体介导的体内递送。听觉功能通过ABR和DPOAE评估。分子变化通过qPCR、Western blot、免疫荧光、流式细胞术和TEM评估。
四、研究结果
3.1 转录组分析鉴定老年周细胞中IGF-1/SLC25A33失调和TGF-β通路激活，可能与血管纹退化和ARHL相关
与年轻小鼠相比，老年动物表现出显著听力损伤。ABR检测显示85%的老年小鼠对低于70 dB SPL的刺激无反应。点击诱发ABR阈值在老年小鼠中显著升高，所有测试频率的阈值均显著增加。DPOAE阈值在17.44 kHz处显著升高。对FACS纯化周细胞的转录组测序显示，老年周细胞中Igf1和Slc25a33 mRNA显著下调。DO富集中presbycusis是最富集的疾病之一。GO分析中系统发育和细胞分化是最显著的BP注释，细胞骨架和细胞连接是最显著的CC注释。Reactome最富集条目为细胞-细胞连接组织、黏附连接相互作用和细胞连接组织。KEGG通路富集确定TGF-β信号通路是老年样本中最差异激活的通路之一。
3.2 老年血管纹中IGF-1和SLC25A33下调得到确认，体外研究揭示IGF-1调节SLC25A33表达
qPCR确认老年周细胞中Igf1和Slc25a33 mRNA表达下调。免疫荧光染色确认IGF-1和SLC25A33在血管纹中共表达，并显示两种蛋白均显著年龄依赖性下调。重要的是，IGF-1和SLC25A33的年龄依赖性改变在周细胞中最为显著。体外实验中，NVP-AEW541抑制IGF-1信号显著降低Slc25a33 mRNA和蛋白水平，而重组IGF-1处理上调SLC25A33表达，建立了IGF-1和SLC25A33之间的直接调控联系。值得注意的是，IGF-1信号调节在培养周细胞中直接调控SLC25A33表达，而在内皮细胞中未观察到这种效应。
3.3 SLC25A33缺乏诱导mtROS产生并驱动周细胞分化
使用MitoSOX Red评估mtROS水平，Slc25a33抑制（通过shRNA）显著增加mtROS产生。周细胞表型转换评估显示，SLC25A33缺陷周细胞中α-SMA在mRNA和蛋白水平均显著上调，而E-cadherin显著下调，表明屏障稳定特性丧失。
3.4 TGF-β/Smad2信号通路介导SLC25A33调控的周细胞分化
qPCR和Western blot分析显示，Slc25a33抑制的周细胞中Tgf-β mRNA和蛋白水平显著升高。虽然总Smad2/3/4表达不变，但p-Smad2在敲低组中显著增加，表明经典TGF-β/Smad2轴选择性激活。p-Smad3无显著变化，支持通路特异性。MitoTEMPO处理降低mtROS并减少TGF-β、p-Smad2和α-SMA表达，验证线粒体ROS作用于TGF-β激活上游。TGF-β受体抑制剂LY2109761处理SLC25A33缺陷周细胞显著下调p-Smad2和α-SMA蛋白水平，同时增加E-cadherin表达。
3.5 体内IGF-1调节调控衰老血管纹中SLC25A33表达
通过圆窗膜微注射向老年小鼠递送IGF-1或其抑制剂NVP-AEW541。免疫荧光显示外源性IGF-1补充显著增强血管纹中SLC25A33表达，而IGF-1抑制进一步降低其表达。qPCR确认外源性IGF-1补充上调Slc25a33 mRNA水平，而IGF-1抑制降低其表达。
3.6 SLC25A33在体内调节周细胞表型和TGF-β信号
使用AAV介导基因递送操纵小鼠血管纹中Slc25a33表达。Slc25a33过表达显著降低α-SMA水平，而其抑制增加α-SMA免疫反应性。E-cadherin表达呈相反模式。与体外结果一致，TGF-β和p-Smad2水平在Slc25a33过表达组中最低，在抑制组中最高。此外，LY2109761抑制TGF-β信号增加血管纹中Claudin-5和Occludin水平，表明BLB破坏得到缓解。
3.7 IGF-1缺乏破坏BLB完整性和听力功能，而IGF-1补充挽救两者
TEM显示IGF-1抑制的老年小鼠中周细胞形态异常，与内皮细胞关联松散，紧密连接增宽。外源性IGF-1给药保持周细胞-内皮相互作用并恢复紧密连接完整性。功能上，IGF-1抑制加剧老年小鼠听力损失，而IGF-1补充显著降低点击诱发ABR阈值，在12 kHz处ABR阈值显著改善，证明听觉敏感性功能恢复。
五、讨论总结
本研究确定了一个先前未被认识的通路：年龄相关IGF-1缺乏下调血管纹周细胞中的线粒体载体SLC25A33，导致mtROS积累、TGF-β/Smad2信号级联激活，以及随后的周细胞表型转换——最终导致BLB破坏和听力损伤。这些发现确立IGF-1/SLC25A33–TGF-β/Smad2轴作为衰老耳蜗微血管完整性的关键调节因子。
研究局限性包括：IGF-1是否直接通过IGF-1R作用于周细胞或间接通过自分泌/旁分泌网络需要细胞特异性敲除模型进一步研究；IGF-1可能调节其他有助于BLB稳定的线粒体和细胞保护基因；物种差异和脑与耳蜗周细胞身份差异可能影响结果解释。
六、研究结论
本研究揭示了一个新的IGF-1-SLC25A33-mtROS-TGF-β/Smad2-周细胞活化轴，将激素信号与衰老耳蜗中的微血管退化联系起来。这项工作不仅推进了对ARHL发病机制的理解，还确定SLC25A33作为在老龄化人群中保护听力的潜在生物标志物和治疗靶点。靶向周细胞介导的BLB功能障碍可能代表感音神经性听力损失治疗的新前沿。
