《Aging Cell》：Single-Cell Mapping Identifies Aging-Associated Neutrophil Remodeling Across Multiple Organs
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衰老伴随着多器官进行性免疫重塑和功能衰退。然而，中性粒细胞及其异质性状态在这些过程中的作用仍未完全阐明。研究人员整合了年轻和老年小鼠多器官的单细胞RNA测序数据集，以表征衰老相关的中性粒细胞重塑。研究人员鉴定了中性粒细胞丰度和状态组成中器官依赖性的变化，以及富
衰老伴随着多器官进行性免疫重塑和功能衰退。然而，中性粒细胞及其异质性状态在这些过程中的作用仍未完全阐明。研究人员整合了年轻和老年小鼠多器官的单细胞RNA测序数据集，以表征衰老相关的中性粒细胞重塑。研究人员鉴定了中性粒细胞丰度和状态组成中器官依赖性的变化，以及富集于炎症、氧化应激、补体和IL-6相关转录程序的中性粒细胞亚群。在体外实验中，暴露于从老年小鼠分离的中性粒细胞条件培养基或IL-6刺激的中性粒细胞样细胞，可增加血管平滑肌和肝细胞来源细胞中的炎症及衰老相关反应。骨髓单细胞分析进一步揭示了衰老相关的祖细胞组成和转录状态变化，包括一个以增强髓系启动为特征的老年富集HPC11群体。计算机模拟扰动分析提名FGF为HPC亚型特异性转录程序的候选调控因子。综上所述，该研究提供了定义衰老过程中中性粒细胞重塑的多器官单细胞资源，并强调了与年龄相关炎症组织环境相关的候选中性粒细胞状态和潜在信号轴。
论文解读文章
一、研究背景与研究意义
衰老是一个伴随多器官进行性功能衰退的复杂生物学过程。2025年，Kroemer和López-Otín提出了精准老年医学的概念，整合了既定的衰老标志，并强调识别驱动年龄相关功能衰退机制的重要性。免疫系统在衰老过程中发生显著变化，包括免疫细胞组成改变、细胞因子分泌增加，以及对衰老细胞的识别和清除能力受损。中性粒细胞作为骨髓来源的主要固有免疫细胞类型之一，通过吞噬、脱颗粒和形成中性粒细胞胞外陷阱（NETs）来清除微生物。近年来的研究表明，中性粒细胞可通过疾病背景依赖的机制参与病理过程，包括过度的NETs形成和异常的粒细胞生成，这些过程可产生具有改变炎症功能的非典型中性粒细胞群体，并已在卒中、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化和牙周炎等疾病中得到不同程度的研究证实。
尽管外周血中性粒细胞比例在衰老过程中的变化仍存在争议，但多项研究表明老年个体的中性粒细胞功能能力下降或失调。中性粒细胞还能以活性氧（ROS）依赖性方式诱导旁分泌端粒功能障碍和细胞衰老。此外，年龄相关的微血管改变增强了白细胞与内皮的黏附并干扰正常渗出过程。在炎症过程中，老年小鼠中性粒细胞的逆行内皮迁移可促进远端器官损伤，提示衰老的血管环境可能促进中性粒细胞跨器官再分布。因此，系统表征稳态衰老条件下中性粒细胞的变化，对于理解固有免疫重塑如何促进多器官衰老具有重要意义。
尽管目前已可获得大量老年小鼠器官的单细胞转录组数据集，但这些数据在多器官衰老背景下关于中性粒细胞生物学的研究仍不充分。本研究整合了老年和年轻小鼠的多器官RNA测序数据集，系统鉴定衰老相关的中性粒细胞亚型图谱，并寻找最具衰老相关性的中性粒细胞亚群，这可能是指示和促进多器官衰老的潜在中性粒细胞程序。
二、研究内容与主要结论
研究人员整合了来自年轻和老年小鼠8种组织（肺、心、脑、血管、外周血、肠、肾和肝）的单细胞数据集，经过质量控制、聚类和细胞类型注释，并通过互惠主成分分析（RPCA）整合消除批次效应，构建了包含256,949个细胞的统一图谱。研究发现在老年小鼠的多个组织中中性粒细胞丰度增加，其中肝脏、肺、血管和肠道的升高尤为显著，而脑中未检测到显著增加，可能反映了血脑屏障的限制作用。通过免疫荧光染色和流式细胞术进一步验证了老年小鼠多器官及骨髓中中性粒细胞的增加。
在功能层面，研究人员构建了包含5,210个中性粒细胞的单细胞图谱，通过伪批量差异表达分析发现老年中性粒细胞中糖酵解和ROS通路富集，而年轻中性粒细胞中TNF-α信号和IFN-λ信号通路富集。体外实验表明，老年小鼠中性粒细胞表现出增强的细胞死亡和NETs形成倾向，其条件培养基可增加血管平滑肌细胞（MOVAS）和肝细胞（AML-12）中β-半乳糖苷酶阳性细胞比例，并上调细胞外基质重塑标志物（MMP12、MMP9）和细胞衰老相关信号分子（P16、P21）的表达。
通过重新聚类，研究人员鉴定了16种转录性中性粒细胞亚型（Neu01-Neu16），并发现老年小鼠主要富集于Neu05-补体、Neu06-IL6和Neu08-E2F亚群，而年轻小鼠则富集于Neu01-TNFA和Neu04-Myc亚群。功能模块评分显示，Neu05和Neu06在NETs形成、吞噬、ROS产生等多项功能特征中得分较高。跨组织共现分析鉴定了7个共变多细胞模块（CMs），其中CM3是最富含中性粒细胞的模块，包含多个老年富集的中性粒细胞状态。CellChat分析提示老年小鼠中趋化因子信号网络上调，肝星状细胞和成纤维细胞被预测向中性粒细胞传递更强的趋化信号，老年富集的Neu06-IL6和Neu05-补体亚群与CXCL1-CXCR2配受体对相关。
针对Neu06-IL6亚群的深入研究显示，该亚群在伪时间轨迹中分布于远端高伪时间区域，STAT3在Neu06-IL6细胞中上调并沿老年伪时间轨迹增加。IL-6刺激HL-60中性粒细胞样细胞可诱导STAT3激活和ROS产生增加，其条件培养基可增强MOVAS和AML-12细胞中衰老相关和细胞外基质相关分子的表达。NicheNet分析提名了ANGPTL4、BMP2、BMP4、IGF2和CX3CL1等候选配体-受体轴与Neu06-IL6相关。
在骨髓造血重塑方面，研究人员分析了老年和年轻小鼠的骨髓单细胞转录组，鉴定出11种转录性HPC亚型，其中HPC11在老年小鼠中富集且具有髓系偏向的转录程序，高表达Gata2、Car2、Prtn3和Rbp1等髓系相关基因。NicheNet和计算机模拟基因扰动分析提名FGF2和Angptl4为与HPC11相关的候选上游信号。
三、关键技术与方法
本研究主要采用了以下关键技术方法：单细胞RNA测序数据分析与整合（使用Seurat R包，通过锚点整合工作流和RPCA整合消除批次效应）；伪批量差异表达分析（以生物学样本为推断单位，使用DESeq2）；单细胞组成数据分析（scCODA，贝叶斯框架用于差异丰度分析）；细胞类型共现分析（鉴定跨样本共变的多细胞模块）；细胞间通讯分析（CellChat，预测配体-受体相互作用）；配体-靶基因预测（NicheNet框架）；转录因子调控网络分析（SCENIC）；计算机模拟基因扰动分析（scTenifoldKnk）；伪时间轨迹分析（Monocle 3）；以及体外实验验证（包括中性粒细胞分离培养、条件培养基处理、免疫荧光、流式细胞术、蛋白质印迹和定量PCR等）。样本来源包括公共数据集（如Tabula Muris、Tabula Sapiens和GSE17440等）以及研究人员自身的实验样本。
四、研究结果
R1. 老年小鼠多器官中性粒细胞积累增加：通过整合8种组织的单细胞数据集，发现老年小鼠肝脏、肺、血管和肠道中中性粒细胞丰度显著增加，并通过免疫荧光和流式细胞术验证。
R2. 老年小鼠中性粒细胞表现出增强的炎症和效应相关程序：伪批量差异表达分析和通路富集显示老年中性粒细胞富集糖酵解和ROS通路；体外实验表明老年中性粒细胞NETs形成增加，其条件培养基可诱导组织细胞衰老样反应。
R3. 衰老与跨组织非典型中性粒细胞状态的扩增相关：鉴定出16种中性粒细胞亚型，老年小鼠富集于补体相关（Neu05）、IL-6相关（Neu06）和E2F相关（Neu08）亚群，这些亚群具有高骨髓邻近评分和早期骨髓相关中性粒细胞转录相似性。
R4. 跨组织共现分析揭示与趋化因子重塑相关的衰老相关中性粒细胞模块：鉴定出7个细胞模块，其中CM3为最富含中性粒细胞的模块，包含多种老年富集中性粒细胞状态，并与内皮细胞和成纤维细胞共变；趋化因子分析提示老年小鼠中CXCL1-CXCR2信号增强。
R5. 老年富集的Neu06-IL6中性粒细胞与炎症组织重塑相关：伪时间分析显示Neu06-IL6分布于远端高伪时间区域，STAT3沿老年伪时间轨迹增加；IL-6刺激可诱导中性粒细胞样细胞炎症和氧化特征，其条件培养基可增强组织细胞衰老相关反应。
R6. 解析老年组织环境中与Neu06-IL6中性粒细胞相关的潜在因子：NicheNet分析提名ANGPTL4、BMP2、BMP4、IGF2和CX3CL1为候选配体，这些配体与P53、TNFα和TGFβ信号通路相关。
R7. 衰老与老年富集HPC11状态及粒细胞生成程序重塑相关：骨髓单细胞分析显示老年小鼠粒细胞生成群体扩增，鉴定出老年富集的HPC11祖细胞状态，具有髓系偏向转录程序，FGF2和Angptl4被预测为其候选上游信号。
五、讨论与结论
讨论部分指出，本研究构建了整合的中性粒细胞表达图谱并将其细分为16种转录性亚型，其中补体相关Neu05、IL-6表达Neu06和E2F相关Neu08在老年组织中富集。IL-6作为衰老中发挥复杂关键作用的多效性细胞因子，在老年个体中循环水平升高，与多种年龄相关疾病相关。研究支持IL-6相关中性粒细胞状态可能放大衰老过程中的炎症组织环境的模型，但体内直接因果关系仍需建立。骨髓分析揭示的HPC11状态与衰老过程中造血髓系偏向一致，FGF和Angptl4相关信号及Gata2等髓系相关转录因子活性增加可能将衰老骨髓微环境与髓系偏向输出联系起来。
研究结论指出，研究人员在多个组织中鉴定了衰老相关的中性粒细胞状态，并观察到多个老年器官中中性粒细胞积累增加，伴随炎症、氧化应激、补体相关和IL-6相关转录程序。通过整合单细胞分析、组织水平验证和体外条件培养基实验，研究结果表明衰老相关的中性粒细胞状态可能促进炎症组织环境。这些发现为研究衰老过程中的固有免疫重塑提供了资源和假设生成框架。
