《Journal of Extracellular Vesicles》：Conserved and Tissue-Specific RNA and Protein Cargos of Small Extracellular Vesicles From 120 Tissue Sites Across 34 Organs in a Single Pig
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小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs）携带参与细胞间通讯所必需的多类货物，但其在所有组织中的全生物体范围表征仍有限。在此，研究人员展示了一个覆盖同一只猪120个组织位点、四种体液和九种胃肠道内容物全身范围的多组学s
小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs）携带参与细胞间通讯所必需的多类货物，但其在所有组织中的全生物体范围表征仍有限。在此，研究人员展示了一个覆盖同一只猪120个组织位点、四种体液和九种胃肠道内容物全身范围的多组学sEV图谱。研究人员通过质谱（mass spectrometry, MS）、二代和三代RNA测序（next- and third-generation RNA sequencing, NGS/TGS）在sEV中鉴定到7995种蛋白质、337种miRNA以及105,409条转录本（其中93,409条为全长转录本）。其中，研究人员定义了一个由252种蛋白质、18种miRNA和1227条转录本组成的保守货物集合，包括RNA结合蛋白（RNA-binding proteins, RBPs；ANXA2、ALIX和MVP）、线粒体蛋白（ATP5F1A、COX6C和VDACs）、let-7 miRNA家族以及铁蛋白基因（FTH1/FTL）。值得注意的是，与sEV生物发生相关的ACTG1、CFL1和ANXA2在所有样本中均被检测到，提示其有潜力作为新型sEV蛋白标志物。相比之下，2638种蛋白质、152种miRNA和1000条转录本表现出器官特异性表达模式，这些模式可能支撑器官特异性生物学过程。此外，通过使用该多组学数据集和额外的RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation, RIP）实验，研究人员发现HNRNPU参与将缺氧响应性EPAS1分选进入sEV。该综合性sEV图谱为未来sEV细胞生物学研究奠定了基础。
细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是细胞间通讯的关键介质，包括外泌体、ectosomes、凋亡小体等亚群。依据MISEV2023指南，研究人员在本研究中采用操作术语“小细胞外囊泡”（small extracellular vesicles, sEVs）。sEV异质性已在体液和细胞系中被广泛认识，而直接从组织分离sEV可提供生理相关的体内快照并表现组织特异性异质性。然而，当前组织sEV研究主要集中于肿瘤和中枢神经系统，虽已开始涉及心、肝、脑等组织并揭示器官间和器官内差异，但跨多样器官系统的全面研究仍缺乏，限制了对一个生物体内多组织sEV组成、保守模式和 tissue-specific（组织特异性）变异的系统理解。sEV蛋白既可作为功能效应物，也可作为囊泡身份标志物，但现有标志物多来自体外培养细胞，其在组织来源sEV中的普适性需验证。sEV-miRNA和mRNA具有诊断与治疗潜力，但系统组织水平见解仍有限，全长mRNA在天然sEV中的内源运输能力也需系统研究。猪因基因组、生理和解剖与人相似，是重要生物医学模型。为此，研究人员建立了包含133个样本（120个组织位点）的猪sEV图谱，整合蛋白质组、小RNA和转录组，鉴定保守与器官特异性sEV货物，比较测序平台，并构建多组学相互作用网络。该研究发表于《Journal of Extracellular Vesicles》，为sEV来源追踪和临床应用提供了基础。
为开展研究，研究人员从F12群体选取两只240日龄健康全同胞猪，其中127个样本来自一只去势公猪，6个雌性生殖组织样本来自全同胞母猪；另取三头商业猪的新鲜肝和肺评估酶解影响。关键技术包括：组织、体液和胃肠道内容物采集，胰蛋白酶消化组织，差速离心联合30%蔗糖垫超速离心分离sEV；NanoFCM和透射电镜表征；质谱4D无标记蛋白质组、小RNA测序、二代测序和Oxford Nanopore三代RNA测序；RIP-seq和RIP-qPCR；多组学相关网络、Western blot、RT-qPCR及免疫荧光验证。
在“3.1 来自133个样本的猪sEV表征”中，研究人员通过比较胰蛋白酶法与Collagenase II/Dispase II混合酶法，结合NanoFCM、透射电镜、Western blot和Proteinase K保护实验，发现两种方法所得sEV粒径峰值约75 nm，呈杯状形态，表达CD81、TSG101和ALIX，且内部货物受脂质双层保护。利用胰蛋白酶流程，研究人员从34个器官的133个样本中分离sEV，样本主要来自同一公猪，雌性生殖器官来自全同胞母猪。sEV粒径呈经典分布，粒子数、RNA和蛋白产量存在器官异质性；脾RNA最高、肌肉蛋白最高，脂肪和雄性生殖系统最低；小肠、肾、腺体、肺、肝和脑在粒子、蛋白和RNA产量上均居前列。sEV分为EV1（<60 nm）、EV2（60–80 nm）和EV3（80–150 nm），脑和脊髓富集EV1，脑EV1比例高3.3倍；RNA含量与EV3弱正相关（r=0.20，p=0.02），蛋白含量与三种粒径无显著相关。结论为器官间sEV分泌能力和粒径分布存在异质性。
在“3.2 sEV蛋白质的分类与跨器官保守性”中，研究人员对131个猪样本进行蛋白质组分析，共鉴定8716种sEV蛋白，保留7995种用于分析；平均每个器官检测3468.5种蛋白，脑和脊髓最高。GO细胞组分富集支持sEV纯度。6752种为已知sEV蛋白，1263种为新发现；还鉴定到3478种RBPs、98种转录因子、3132种膜蛋白、485种分泌蛋白、3282种受体和3513种配体。相关热图显示器官内相关性高于器官间。研究人员定义252种跨器官保守核心sEV蛋白，包括线粒体相关蛋白、183种RBPs和20种MISEV2023推荐EV标志物；10种蛋白在所有131个样本中检测到并属MISEV2023第2类。基于sEV生物发生功能，推荐ACTG1、CFL1和ANXA2作为稳健候选标志物。经典标志物检测呈异质性，CD63为97%、CD9为94%、CD81为83%；MSN为99%、Syntenin-1为94%。候选标志物在133个样本中100%覆盖，且两种酶解方法下均可检测。脂蛋白污染物丰度明显低于CD63。结论为跨器官保守蛋白和新型候选标志物得到鉴定。
在“3.3 体液中可检测的器官特异性sEV蛋白质”中，研究人员使用Yanai组织特异性指数tau（τ）量化129个样本中sEV蛋白分布，tau>0.85定义2638种高度器官特异性sEV蛋白，其中1023种为膜相关。脊髓、扁桃体和脑分别鉴定到500、295和199种特异蛋白，代表标志物包括NSG1、CD8B、NCAM1和SYT17。PigGTEx数据库、Western blot、单细胞转录组和免疫荧光支持其组织及细胞来源，如SFTPC主要定位于肺泡1型和2型细胞，NNMT定位于肝细胞。体液分析中，血浆和尿sEV分别检测到195和108种器官特异性sEV蛋白，其中23种重叠。尿sEV中肾特异蛋白数量最多（35种）且相对丰度最高（38.22%），血浆sEV中脊髓特异蛋白数量最多（32种）且相对丰度最高（16.96%）。结论为器官特异性sEV蛋白可在体液中检测，且不同体液对器官生理监测存在偏好。
在“3.4 sEV中保守和器官特异性miRNA特征”中，小RNA测序获得179.4亿原始reads，平均910万高质量clean reads。sEV小RNA组成平均为miRNA 32.32%、tRNA 33.68%、mRNA片段15.87%。共鉴定337种成熟sEV miRNA，脑、肺和小肠最多。其中18种为保守miRNA，152种为器官特异性miRNA。保守miRNA包括let-7家族，丰度高，靶基因富集于MAPK信号和內质网蛋白加工等。器官特异性miRNA主要来自肺、腺体和脊髓，代表包括肌肉miR-1、肺miR-126-3p、肝miR-122-5p、脑miR-149和胰腺miR-216。RT-qPCR和公共猪miRNA-seq数据支持其表达趋势。体液sEV中，血浆、尿、胆汁和脑脊液分别检测到175、216、112和90种miRNA；let-7a、let-7e、let-7f-5p、let-7i-5p和miR-26a在全部体液sEV中最丰富且保守。体液sEV还检测到83、107、56和44种器官特异性miRNA，29种共享miRNA主要来自肺、脊髓和唾液腺，其靶基因富集于含氧化合物反应、蛋白运输、细胞定位调控和囊泡介导运输。结论为器官特异性sEV-miRNA可作为组织来源基线标志物，保守sEV-miRNA可能参与细胞增殖调控。
在“3.5 长读长转录组分析揭示sEV的器官特异性复杂性及功能见解”中，研究人员对119个样本进行Oxford Nanopore三代测序，获得16.3亿原始reads，质控后15.9亿reads，其中12.5亿为全长reads，总长1.02 Tb。整合分析鉴定96,474条新转录本，对应14,789个蛋白编码基因。保留105,409条TPM>1转录本，对应25,399个基因，其中93,409条（88.6%）由full-splice-match reads支持。与二代测序比较，共享基因88.1%，R
2=0.65。器官内相关性高于器官间。研究人员鉴定1010个保守EV组织基因，FTH1和FTL在sEV中分别比组织高11.3倍和22.6倍，核糖体蛋白基因占高表达sEV基因的40%，121个核糖体蛋白基因在sEV转录组中持续检出。还鉴定37个EV缺失基因，其中34个对应蛋白在任何组织sEV中未检出。基于表达水平和tau值，鉴定3174个器官特异性sEV基因和6891个器官特异性转录本，转录本器官特异性更高。661个在TGS和NGS中均器官特异的基因中，422个（63.8%）器官来源一致，肝、骨髓和胰腺一致性最高。功能富集与来源器官生理功能一致。RT-qPCR、PIGOME和IGV验证了保守基因FTH1、FTL及肝ALB/FGG、肺SFTPB/SFTPC的器官特异性。结论为sEV转录本比sEV基因更能精确指示组织起源。
在“3.6 sEV货物相互作用网络的全局映射”中，研究人员基于Spearman相关构建sEV货物相互作用网络，发现RBP、miRNA和mRNA之间存在强正相关，且许多相关对为RNAInter数据库记录的互作伙伴。PTBP1、TARDBP及miR-30c、miR-424、miR-142显示高互作潜力；13个RNAInter注释RBPs和miR-424-3p与伙伴RNA强相关。三个mRNA（EPAS1、PTPN18和CNN2）含与RBP匹配的基序；EPAS1 mRNA含三个HNRNPU预测结合基序，与HNRNPU表达相关r=0.7。RIP-seq确认HNRNPU结合EPAS1 mRNA，RIP-qPCR验证富集12.3倍（p<0.05，n=3）。肺来源sEV中可检测EPAS1 mRNA尤其全长转录本，但未检测到其编码蛋白，提示RBP介导的mRNA特异性细胞间通讯途径可能不依赖蛋白翻译。研究人员还发现6842个编码基因的mRNA和蛋白在sEV中均检测到，蛋白的跨器官表达保守性高于mRNA，mRNA-蛋白相关系数为?0.5至0.75；897个蛋白专属货物比15,052个mRNA专属货物更具器官特异性。功能富集显示保守蛋白、保守mRNA及保守miRNA靶基因均富集于囊泡介导运输调控、羧酸代谢、蛋白分解、细胞器蛋白定位、细胞因子反应和细胞组分生物发生调控。结论为sEV通过部分独立机制包装mRNA和蛋白，但货物网络功能协调。
讨论部分指出，组织来源sEV多组学图谱对理解器官间sEV货物多样性、生物学功能、协同运输机制和临床标志物至关重要。现有sEV研究多依赖培养细胞或体液，难以捕获组织微环境局部分子特征；此前仅有一项肿瘤组织sEV蛋白质组研究覆盖18种肿瘤类型和85名供体。本研究以猪为模型，建立迄今最全面的120个组织位点组织来源sEV多组学图谱。sEV分离无最优方法，超速离心联合30%蔗糖垫可提高纯度和产量并保持操作简便；但脂蛋白可与组织来源sEV共分离，未来需用替代方法验证。sEV产量存在异质性，肝sEV在粒子、蛋白和RNA水平高于心sEV，脂肪组织最低，可能与脂肪细胞密度低和组织解离不完全有关。小肠、肾、腺体、肺、肝和脑在三种产量指标中均居前10。保守sEV货物包括线粒体相关蛋白、let-7家族miRNA和铁蛋白mRNA。经典标志物CD9、CD63和CD81在组织来源sEV中呈异质性，ACTG1、CFL1和ANXA2在133个样本中100%覆盖。三代测序中仅24%总reads为full-splice-match reads，提示片段RNA为sEV主要群体，与独立ONT研究一致，而PacBio研究报道的78.5%全长转录本可能反映大小选择偏差。研究结论翻译如下：总之，该研究提供了猪组织来源sEV的基础多组学图谱，显著推进了对sEV跨器官变异的理解，是阐明复杂生物体中sEV介导的组织间通讯网络的关键开创性一步。尽管该图谱提供了sEV器官特异性的全面视图，未来仍需更大多个体队列验证发现并评估生物变异。此外，拥有足够sEV材料的研究可纳入消化前标准化策略（例如基于sEV蛋白质量或粒子数）作为额外质控层，以进一步增强蛋白质组定量的稳健性。未来与bulk或单细胞转录组学整合将进一步阐明sEV细胞来源并提供机制见解。该资源还可为猪或其他研究模型中的细胞-细胞通讯、跨器官通讯和sEV货物协调运输提供有价值见解。
