《Journal of Neuroendocrinology》：Estrogen/Esr2b signaling-dependent, female-biased expression of a neuropeptide Y gene in the medaka brain
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近期研究表明，缺乏雌激素受体基因esr2b的雌性青鳉（Oryzias latipes）对雄性求偶行为不敏感，反而会向其他雌性求偶。本研究调查了esr2b缺陷雌鱼的脑转录组，以探索该行为表型的潜在机制，并鉴定出npyb——硬骨鱼类两个神经肽Y（NPY）基因之一—
近期研究表明，缺乏雌激素受体基因esr2b的雌性青鳉（Oryzias latipes）对雄性求偶行为不敏感，反而会向其他雌性求偶。本研究调查了esr2b缺陷雌鱼的脑转录组，以探索该行为表型的潜在机制，并鉴定出npyb——硬骨鱼类两个神经肽Y（NPY）基因之一——显著下调。后续分析显示，npyb在与交配行为相关的腹侧端脑核团中呈现明显的雌性偏向表达，且依赖于雌激素/Esr2b信号。这些发现使研究人员假设npyb可能介导esr2b缺陷的表型后果。为验证该假设，研究人员生成了npyb缺陷青鳉并评估其交配行为；然而，未观察到明显异常。鉴于硬骨鱼中另一个NPY基因npya也在同一脑核团中表达，研究人员考虑了npya补偿npyb功能缺失的可能性。尽管如此，即使同时缺乏npya和npyb的青鳉也未表现出可辨别的交配行为缺陷。虽然NPY在青鳉中的精确生理作用仍不清楚，但本研究的发现确立了npyb作为雌激素/Esr2b信号的下游靶基因，并证明了其在行为相关脑区的雌性偏向表达。
论文解读
一、研究背景与科学问题
交配行为在雄性和雌性中通常是先天的且具有性别特异性。在脊椎动物中，这类行为在很大程度上由性类固醇激素塑造，包括雄激素、雌激素和孕激素。这些由性腺以性别特异性方式分泌的激素作用于交配行为的神经底物，建立雄性和雌性典型的行为模式。其效应主要通过作为转录因子发挥作用的核受体介导，调控靶基因的表达。然而，尽管近年来在鉴定交配行为所必需的类固醇受体表达神经元方面取得了进展，但介导类固醇受体信号并驱动性别典型行为模式的具体下游基因仍然在很大程度上未被鉴定。
研究人员近期发现，缺乏esr2b（三个雌激素受体基因之一）的雌性青鳉保留正常的卵巢功能和不变的性类固醇环境，但对雄性完全无反应，反而向其他雌性求偶。这一发现表明雌激素/Esr2b信号对诱导雌性典型的交配行为和性偏好至关重要，同时抑制雄性典型行为。与esr2b不同，青鳉中另外两个ESR基因esr1和esr2a的缺陷不影响雌性交配行为，凸显了Esr2b的独特作用。
目前已知影响雌性交配行为的雌激素/Esr2b信号唯一下游靶基因是npba，编码神经肽B。在雌激素/Esr2b信号控制下，npba在与硬骨鱼交配行为相关的脑核团中以雌性特异性方式表达，其功能缺失损害雌性交配行为。然而，由此产生的行为缺陷相对温和，暗示雌激素/Esr2b信号下游存在其他关键靶基因。因此，研究人员在本研究中调查了esr2b缺陷雌鱼的脑转录组，以探索额外的下游靶基因，从而鉴定出一个编码神经肽Y的基因是最显著下调的基因之一。
二、研究设计与技术方法
研究人员使用了野生型d-rR品系青鳉以及esr2b、npya、npyb或npya/npyb双缺陷的突变青鳉。主要关键技术方法包括：RNA测序（RNA-seq）分析，将大脑解剖为四个区域进行转录组测序和差异表达基因（DEG）鉴定；实时PCR定量验证基因表达水平；单标记原位杂交（ISH）定位基因表达脑核团；卵巢切除及激素处理实验验证雌激素依赖性；双标记原位杂交检测基因共表达；转录活性测定评估雌激素直接转录调控；CRISPR/Cas9介导的基因组编辑生成突变青鳉品系；以及标准化交配行为测试。
三、研究结果
3.1 鉴定npyb为esr2b缺陷雌鱼脑中下调基因
通过对esr2b缺陷雌鱼大脑四个区域的RNA-seq分析，鉴定出14个DEG。其中XLOC_008613（后被确认为npyb）在端脑/嗅球区域表达显著降低至野生型的18%。系统发育分析确认该基因编码青鳉Npyb直系同源物。实时PCR验证显示，esr2b缺陷雌鱼端脑/嗅球区域npyb表达降至野生型雌鱼的8.8%，且该区域表达呈现强烈雌性偏向：野生型雄鱼表达水平与esr2b缺陷雌鱼相当。
3.2 腹侧端脑中npyb的雌激素/Esr2b信号依赖性雌性偏向表达
原位杂交显示npyb在腹侧端脑Vs/Vp核团、视前区PMp和脑干gc中表达。其中Vs/Vp区域的npyb表达在esr2b缺陷雌鱼中显著降低至野生型的16%，并呈现雌性偏向。卵巢切除显著降低Vs/Vp中npyb表达，E2处理可完全恢复，而11KT无此效应。双标记原位杂交显示99%的npyb表达神经元同时表达esr2b。尽管在npyb基因座上游和下游鉴定出三个ERE样序列，但转录活性测定未显示雌激素依赖性诱导，提示雌激素可能通过间接机制调控npyb表达。
3.3 npyb突变体中交配行为、生长或成熟无可检测缺陷
利用CRISPR/Cas9生成两个独立npyb缺陷品系（Δ5和Δ29），均携带导致移码和提前终止的突变。突变鱼在体长、体重、性腺重量和性腺/体重比方面与野生型同胞无显著差异。交配行为测试显示，npyb缺陷雌鱼接受雄性追随、求偶展示和包裹的潜伏期及产卵潜伏期均与野生型相当，接收求偶展示次数和拒绝包裹次数也无差异。npyb缺陷雌鱼未表现出向其他雌性求偶的行为。npyb缺陷雄鱼的所有行为指标也与野生型无显著差异。
3.4 野生型和esr2b缺陷雌雄鱼脑中npya表达的空间分布
鉴于npyb缺陷未产生行为表型，研究人员考虑npya可能功能补偿。通过原位杂交发现npya在腹侧端脑Vl和Vs/Vp、视前区PMp、下丘脑NVT/NRL和NPPv以及视顶盖PGZ3中表达。Vs/Vp中npya表达在基因型间和性别间均无显著差异，表明npya不受雌激素信号调控。双标记原位杂交显示npya和npyb表达神经元分别位于Vs/Vp的腹侧和背侧，无共定位。此外，研究人员确认青鳉保留pyya和pyyb两个PYY基因，但二者均不在Vs/Vp中表达，且不受雌激素/Esr2b信号调控。
3.5 npya/npyb双突变体中交配行为、生长或成熟无可检测缺陷
研究人员进一步生成npya/npyb双缺陷鱼。除双缺陷雌鱼性腺/体重比略有降低外，体长、体重和性腺重量均无异常。行为测试显示双缺陷雌鱼接受雄性求偶和产卵的潜伏期与野生型相当，接收求偶展示和拒绝包裹频率也无差异，且未表现出向其他雌性求偶的行为。双缺陷雄鱼行为模式与野生型不可区分。实时PCR分析排除了其他NPY/PYY家族成员转录补偿性上调的可能性。
四、讨论与结论
本研究发现npyb在青鳉Vs/Vp中的表达受雌激素/Esr2b信号控制且呈明显雌性偏向。然而，npyb单缺陷及npya/npyb双缺陷均未导致交配行为缺陷，表明NPY信号并非青鳉交配行为的基本要求。尽管NPY介导的交配行为调控在进化上古老，但其作用可能并非在所有类群中广泛保守。
研究人员讨论了可能解释缺乏行为表型的方法学因素：构成性突变可能导致发育补偿；行为测试可能无法捕捉细微差异。关于Vs/Vp中npyb雌性偏向表达的生理作用，研究人员推测可能与焦虑调节相关，因为啮齿类杏仁核NPY具有抗焦虑作用，但斑马鱼npya缺陷表现出焦虑样行为提示该功能可能由其他脑区介导。
值得注意的是，这是首次报道硬骨鱼脑中npyb表达的性别差异。与先前全脑实时PCR研究未检测到雌激素调控不同，本研究区域特异性原位杂交揭示了Vs/Vp中的显著变化，这种差异可能反映了实验分辨率的区别。转录活性测定未提供直接转录激活的证据，提示雌激素可能通过其他靶基因间接调控npyb，或通过更远端的ERE发挥作用。
与啮齿类中雌激素抑制弓状核NPY表达不同，青鳉Vs/Vp中雌激素上调npyb表达，且啮齿类多个脑区NPY呈雄性偏向而青鳉呈雌性偏向，这些对比表明脑中NPY调控存在物种特异性模式。此外，尽管NPY以调节摄食和能量稳态著称，但青鳉缺乏npya和/或npyb未导致生长异常，与小鼠和斑马鱼中的发现一致，提示发育过程中存在稳健的补偿机制。值得注意的是，青鳉中NPY受体基因而非配体基因的缺失导致生长缺陷，这一配体与受体基因缺失效应之间的差异值得进一步研究。
总之，本研究确立了npyb作为雌激素/Esr2b信号在Vs/Vp中的下游靶基因并呈雌性偏向表达，精确表征了这一主要的雌激素依赖通路，细化了Esr2b下游的分子框架，为鉴定雌性交配行为背后的机制奠定了坚实基础。
