deptor?/?缺失通过胆固醇代谢紊乱导致斑马鱼轴突束与行为异常

《Neurobiology of Disease》：deptor disruption induces axonal and behavioral abnormalities through altered cholesterol metabolism in zebrafish

　　

deptor^?/?斑马鱼表现出轴突束和运动行为异常。胆固醇积累及异常分布是deptor^?/?斑马鱼轴突束和运动行为异常的原因。deptor^?/?斑马鱼表现出髓鞘损伤和炎症反应。

机制性雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin, mTOR）信号通路是细胞功能的高度保守调节者，主要通过mTOR复合物1（mTOR complex 1, mTORC1）和mTOR复合物2（mTOR complex 2, mTORC2）发挥作用。mTORC1参与蛋白合成、脂质代谢、核苷酸合成、mRNA翻译、葡萄糖代谢、自噬以及蛋白泛素化和降解；mTORC2主要调节细胞存活、增殖和生长。DEP domain-containing rapamycin target interacting protein（DEPTOR）是mTOR信号通路的天然抑制剂，也是mTORC1和mTORC2的共同组分。研究人员实验室既往工作显示，MINAR1/UBTOR/KIAA1024通过调节DEPTOR泛素化而稳定DEPTOR，其缺失会导致培养细胞和斑马鱼中DEPTOR降解及mTOR信号过度激活。DEPTOR广泛表达于中枢神经系统和外周组织，在发育后期具有重要生物学作用。尽管DEPTOR与mTOR信号通路关系密切，并在肿瘤学中被广泛研究，但其在神经系统中的作用仍不充分。已有证据将DEPTOR与阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）、精神分裂症和双相情感障碍等神经精神疾病联系起来，但多数研究缺乏明确的神经系统表型及分子机制。近期发现人类DEPTOR基因突变与脑白质微结构异常相关。脑白质富含脂质，固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element-binding proteins, SREBPs）受mTOR通路调控，是调节胆固醇和脂肪酸合成的核心转录因子家族，包括SREBP1和SREBP2；其中SREBP-2对胆固醇合成具有更高特异性。胆固醇对轴突发育、突触形成和神经修复至关重要，脑胆固醇失调参与AD、帕金森病、亨廷顿病、精神疾病和癫痫等。因此，研究人员通过CRISPR/Cas9技术破坏斑马鱼deptor基因，构建deptor^?/?模型，以研究deptor缺失对神经系统的影响。研究人员观察到deptor^?/?斑马鱼mTOR信号通路过度激活，白质轴突束直径增大、排列松散并伴运动缺陷。机制上，deptor缺失导致胆固醇代谢紊乱和脑内胆固醇积累；针对胆固醇代谢的药物干预分别挽救或诱导了这些表型。该研究说明，胆固醇代谢受损驱动deptor缺陷斑马鱼白质轴突束异常和运动缺陷，并提示少突胶质细胞发育缺陷和神经炎症反应。

为开展研究，研究人员采用的主要关键技术方法包括：以CRISPR/Cas9基因编辑构建deptor^?/?斑马鱼，样本来源为斑马鱼（Danio rerio）AB野生型及deptor^?/?品系；用实时定量PCR（quantitative real-time PCR, RT-qPCR）和原位杂交（in situ hybridization, ISH）检测基因表达；用免疫荧光检测磷酸化S6（phosphorylated S6, p-S6）和乙酰化微管蛋白（acetylated tubulin, Ac-Tubulin）；用亲脂性荧光膜染料DiI进行轴突束追踪；用菲律宾菌素（filipin）染色检测未酯化胆固醇；用开放场行为测试分析运动；用2-羟丙基-β-环糊精（2-hydroxypropyl beta-cyclodextrin, 2HPβCD）、依非韦伦（efavirenz）和铜螯合剂cuprizone（CPZ）进行药物干预；用GraphPad Prism进行统计分析。

研究结果如下。

2.1 deptor^?/?斑马鱼的构建：研究人员通过CRISPR/Cas9在deptor第二外显子引入2碱基缺失，导致移码突变和提前翻译终止。RT-qPCR显示野生型斑马鱼中deptor表达在受精后3天（days post-fertilization, dpf）首次可检测，研究在5 dpf验证敲除效率，并主要在10 dpf观察表型。RT-qPCR和ISH均显示deptor^?/?中deptor mRNA显著下调，提示可能触发无义介导的mRNA降解。由于DEPTOR是mTOR信号通路内源性抑制剂，研究人员检测p-S6，发现deptor^?/?脑内p-S6阳性细胞明显增加，确认mTOR信号通路过度激活。因此，成功建立功能性deptor功能缺失斑马鱼模型。

2.2 10 dpf deptor^?/?斑马鱼白质轴突束异常和运动缺陷：鉴于人类DEPTOR突变与脑白质异常相关，研究人员检查10 dpf斑马鱼白质结构。Ac-Tubulin免疫组化显示，野生型轴突束紧密成束，而deptor^?/?中Ac-Tubulin染色分布异常、紊乱。DiI追踪显示，deptor^?/?从前脑到中脑的轴突束直径显著增大，部分轴突轨迹异常，纤维从主束分支；视神经束直径也显著增大。开放场行为测试显示，deptor^?/?总运动次数和总运动时长显著减少，平均每次运动时长增加，表明存在明显运动缺陷。结论是deptor^?/?斑马鱼轴突束排列松散且错向，并伴运动功能受损。

2.3 deptor^?/?斑马鱼胆固醇代谢失调：由于脑白质富含脂质，且SREBPs是mTORC1关键下游效应因子，研究人员检测10 dpf deptor^?/?脑中srebf1和srebf2表达。RT-qPCR和ISH显示srebf2显著下调，而srebf1无显著变化；胆固醇合成限速基因hmgcs1显著下调，胆固醇外流基因abcg1上调。Filipin染色显示deptor^?/?全脑胆固醇信号增强，白质中胆固醇信号弥漫且异常。早期时间点分析显示，5 dpf时deptor^?/?脑中srebf2显著上调，随后至10 dpf逐渐下降，而filipin染色强度逐渐累积。结论是deptor缺失早期过度激活胆固醇合成，导致脑胆固醇进行性积累，并在10 dpf触发srebf2反馈抑制，造成白质局部胆固醇积累和结构紊乱。

2.4 胆固醇代谢失调驱动deptor^?/?斑马鱼轴突束异常和运动缺陷：为建立因果关系，研究人员进行药理学挽救和表型模拟。2HPβCD处理从5至10 dpf显著降低deptor^?/?脑胆固醇水平，消除白质异常弥漫胆固醇分布；DiI标记显示2HPβCD挽救前脑到中脑和视神经束直径增大。由于系统性2HPβCD处理导致多器官毒性、死亡率升高和运动性能严重受损，研究人员采用efavirenz在野生型中进行功能获得实验。2 μM efavirenz处理野生型从5至10 dpf增加脑胆固醇并模拟deptor^?/?白质弥漫染色；开放场行为分析显示efavirenz处理野生型出现明显运动障碍，类似未处理deptor^?/?，而efavirenz未使deptor^?/?运动进一步恶化。结论是降低脑胆固醇可挽救轴突束紊乱，诱导脑胆固醇积累可重现运动缺陷，证明胆固醇代谢失调是白质结构异常和运动功能障碍的主要驱动因素。

2.5 deptor^?/?斑马鱼少突胶质细胞发育缺陷：中枢神经系统中绝大多数胆固醇位于髓鞘。研究人员检测少突胶质细胞和髓鞘标记plp1b（proteolipid protein 1b）。10 dpf野生型中plp1b转录主要位于中脑和后脑。虽然全脑plp1b总染色强度在野生型和deptor^?/?间无显著差异，但细胞计数显示deptor^?/?中脑和后脑plp1b阳性少突胶质细胞数量显著减少。结论是deptor缺失损害少突胶质细胞发育，导致关键脑区成熟少突胶质细胞群减少。

2.6 deptor^?/?斑马鱼脑内神经炎症：研究人员观察到deptor^?/?中胆固醇亚细胞分布异常。野生型filipin荧光主要位于细胞膜，胞内信号很低；deptor^?/?胞质内出现明显filipin荧光。以体细胞/膜信号强度比0.319为阈值，deptor^?/?异常细胞比例显著高于野生型。cuprizone处理野生型增加异常细胞比例，模拟deptor^?/?表型。RT-qPCR显示促炎相关基因aif1l显著上调，il12a可能有一定程度上调，抗炎相关基因arg1和il10显著下调，LXR信号通路关键基因dhcr24显著上调；结合abcg1上调，提示肝X受体（liver X receptor, LXR）信号通路激活。ISH验证arg1表达显著下调。结论是deptor^?/?中存在胞内胆固醇积累并伴随神经炎症。

讨论部分总结：DEPTOR是mTORC1和mTORC2的内源性抑制剂，但其在神经生物学疾病中的研究有限。已有临床和遗传证据将DEPTOR改变与精神疾病和神经发育疾病联系，但缺乏聚焦DEPTOR神经系统功能的体内动物模型。研究人员用CRISPR/Cas9建立DEPTOR功能缺失模型，并通过DiI追踪发现白质结构紊乱。轴突束完整性破坏是多种脑疾病的神经病理特征。虽然结构分析集中在前脑到中脑束和视神经束，但DEPTOR在全脑广泛表达，提示白质轴突束紊乱可能是deptor^?/?斑马鱼多个神经环路中的普遍特征。非神经模型中DEPTOR与脂质调节有关，而本研究中10 dpf srebf2短暂下调初看与mTORC1过度激活促进SREBP处理相矛盾。通过早期发育阶段分析，研究人员解释为：5 dpf时srebf2转录上调反映急性mTORC1过度激活，随后随未酯化胆固醇积累至10 dpf逐渐下降，符合经典胆固醇负反馈抑制SREBP切割和转录。脑是相对隔离的代谢区室，几乎依赖局部从头胆固醇合成，且中枢胆固醇周转缓慢，因此脑胆固醇合成轻度增加即可超过局部清除能力并触发SREBP反馈抑制。由于约70–80%脑总胆固醇位于髓鞘膜，且髓鞘完整性受损加速神经退行和AD发病，研究人员检查髓鞘形成，发现deptor^?/?脑中成熟plp1b阳性少突胶质细胞显著减少。脱髓鞘小鼠模型中受损髓鞘释放的局部胆固醇可触发神经炎症并激活胆固醇转运机制，这与本研究中arg1表达下降、abcg1胆固醇外流转运体表达升高以及胞内胆固醇异常隔离细胞增多一致。基于此，作者提出机制模型：过度激活的mTOR驱动早期胆固醇过度生成，导致髓鞘形成结构紊乱和少突胶质细胞数量减少；松散包裹或未髓鞘化的轴突束直径扩大、轨迹异常，并伴局部神经炎症。

研究结论翻译：总之，本研究建立了deptor^?/?斑马鱼神经发育性白质病理模型。研究证明，过度激活的mTOR-SREBP信号导致发育性胆固醇积累，最终引起轴突束紊乱、少突胶质细胞密度降低和运动缺陷。鉴于临床和临床前试验日益支持针对AD等神经系统疾病的胆固醇靶向策略，恢复胆固醇稳态代表了与DEPTOR缺陷相关疾病的一种有前景的治疗角度。