情境依赖性CCL2-CCR2信号在创伤性与自身免疫性中枢神经系统疾病中驱动不同的免疫浸润程序

《Neurobiology of Disease》：Context-dependent CCL2-CCR2 signaling drives distinct immune infiltration programs in traumatic and autoimmune CNS disorders

　　

CCL2-CCR2在脊髓损伤（SCI, spinal cord injury）中短暂激活，但在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE, experimental autoimmune encephalomyelitis）中持续上调。CCR2缺陷在SCI与EAE模型中以不同方式重塑免疫浸润。CCR2敲除抑制EAE浸润并赋予近乎完全保护。研究结果支持针对中枢神经系统（CNS, central nervous system）精准免疫治疗的阶段特异性趋化因子靶向。

脊髓损伤（SCI, spinal cord injury）是创伤性中枢神经系统（CNS, central nervous system）损伤的经典类型，急性期触发强烈炎症，导致神经元和胶质细胞快速丢失，随后炎症慢性化并抑制少突胶质细胞分化和轴突再髓鞘化。多发性硬化（MS, multiple sclerosis）是慢性免疫驱动CNS疾病，以脱髓鞘、少突胶质细胞丢失、轴突变性和进行性功能障碍为特征，显著影响脑和脊髓白质。两者均涉及炎症驱动的脱髓鞘和再髓鞘失败，但SCI源于急性创伤并突然激活炎症，MS源于自身免疫过程并产生复发或持续炎症。两者均激活CNS免疫细胞如小胶质细胞，并允许外周免疫细胞如单核细胞和淋巴细胞浸润，但免疫动态不同：SCI表现为先天免疫细胞先侵入、适应性细胞后参与的“先天优先、适应后至”模式；MS及其动物模型EAE表现为适应性免疫细胞主要是T细胞先启动病理，随后单核细胞和巨噬细胞持续浸润的“适应优先、先天持续”模式。CCL2-CCR2（趋化因子配体2-趋化因子受体2）通路是免疫细胞进入CNS的主要信号之一，可改变血脑屏障，在SCI和MS中均重要。MS患者脑脊液和血中CCL2、CCR2升高，Ccr2缺失小鼠进入CNS的有害免疫细胞减少并保护神经；急性损伤中阻断该通路也限制有害免疫细胞进入并支持神经愈合，主要因减少免疫细胞进入而非直接保护神经细胞；有时CCL2在实验中可能保护神经。然而，CCL2-CCR2信号的时间动态和细胞类型特异性尚未在SCI与MS间系统比较。因此，研究人员整合人脑脊液测量、单细胞转录组数据和Ccr2缺陷小鼠功能研究，对CCL2-CCR2轴进行系统多层次分析，以揭示急创伤性和自身免疫性CNS炎症中的不同时间动态和细胞类型特异性激活模式，并将其确定为情境依赖性免疫细胞浸润调节因子，为疾病和阶段特异性免疫调节策略提供概念基础。

主要关键技术方法：样本队列来源为中山大学附属第三医院2017—2025年脑脊液（CSF, cerebrospinal fluid）样本，共42例（SCI 25例、MS 12例、对照5例）；公共单细胞数据集GSE162610和GSE129609，共90,453个细胞、37只小鼠。关键技术包括：酶联免疫吸附试验（ELISA）检测CSF CCL2；建立SCI（PSI impactor 70 kdyn）和EAE（MOG_35–55/完全弗氏佐剂（CFA）/百日咳毒素（PT））模型及Ccr2^?/?小鼠；BMS（Basso Mouse Scale）和EAE临床评分；免疫荧光、流式细胞术；单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。

研究结果：
3.1 脑脊液CCL2表达在SCI和MS中呈疾病病程依赖模式。通过ELISA检测人CSF发现，SCI患者在损伤早期（≤2个月）CCL2水平显著升高，而早期和晚期慢性阶段不再升高；MS患者在复发缓解型多发性硬化（RRMS, relapsing-remitting multiple sclerosis）复发或缓解期均未见显著变化，提示CCL2-CCR2通路在SCI与MS早期病程中激活方式不同。
3.2 单细胞测序分析揭示SCI与EAE免疫浸润的细胞谱系和时间动态显著不同。通过分析SCI数据集GSE162610和EAE数据集GSE129609，SCI未损伤脊髓中小胶质细胞为主，1 dpi比例显著下降，7 dpi部分恢复；浸润巨噬细胞3 dpi达峰，粒细胞1 dpi快速增加、7 dpi消失，急性期单核细胞和T细胞比例无显著变化。EAE中浸润单核细胞在priming期快速增至约40%，急性期维持高水平，缓解期仅部分下降；CD4⁺ T细胞急性期显著增加并全程稳定高浸润；小胶质细胞急性期显著下降但恢复慢于SCI。流式细胞术确认浸润巨噬细胞在SCI和EAE急性期均显著增加，而CD4⁺ T细胞显著增加仅见于EAE急性期；基于CD45/CD11b的流式未能捕捉急性期小胶质细胞比例下降，可能因早期炎症中小胶质细胞CD45上调模糊门控边界。结论为SCI以先天免疫细胞早期快速积累为主，适应性免疫参与有限；EAE以适应性免疫尤其CD4⁺ T细胞显著浸润为特征，随后单核细胞持续大量进入CNS。
3.3 CCL2-CCR2通路在SCI与EAE间表现完全不同的表达时间动态和细胞依赖性。单细胞分析显示，SCI中CCR2在1 dpi浸润巨噬细胞和血管周围巨噬细胞显著上调，3–7 dpi快速降至近基线；浸润单核细胞比例极低但CCR2表达全程较高；CCL2在急性期达峰并于7 dpi快速下调。EAE中CCR2在浸润单核细胞和CD4⁺ T细胞从priming期持续增加，贯穿急性期并延伸至缓解期；CCL2在浸润巨噬细胞、血管周围巨噬细胞和小胶质细胞中从早期持续上调。因此，SCI中CCL2-CCR2呈短暂激活，主要促进早期浸润巨噬细胞快速聚集；EAE中呈持续激活，驱动致病CD4⁺ T细胞大量进入并维持长期单核细胞浸润。
3.4 CCR2基因敲除在SCI和EAE中产生不同程度的功能改善和免疫浸润模式重塑。在Ccr2^?/?小鼠SCI模型中，早期运动功能恢复与野生型一致，但21 dpi和28 dpi运动功能更好，28 d后损伤面积更小；急性期浸润巨噬细胞显著减少，CD4⁺ T细胞显著增加。在EAE中，Ccr2^?/?小鼠几乎无典型瘫痪，临床评分持续极低，脱髓鞘病变显著减少；浸润单核细胞、CD4⁺ T细胞和活化小胶质细胞大幅减少；脾中CD4⁺、CD8⁺ T细胞和CD19⁺ B细胞比例增加，提示外周淋巴细胞仍活跃但进入CNS受限。结论为CCR2缺失在两种模型均改善结局，但SCI改善主要在慢性期并伴T细胞异常增加，EAE改善贯穿全程并与巨噬细胞和致病T细胞深刻抑制相关。
3.5 CCR2缺陷改变SCI和EAE中巨噬细胞与CD4⁺ T细胞的空间分布模式。免疫荧光显示，SCI野生型小鼠浸润巨噬细胞主要聚集于损伤核心，CD4⁺ T细胞也主要在核心并与巨噬细胞重叠；Ccr2^?/?小鼠巨噬细胞核心聚集显著减少，CD4⁺ T细胞形成更密集灶状聚集，呈增强的T细胞-巨噬细胞紧密接触。EAE野生型小鼠巨噬细胞均匀分布于脊髓白质，CD4⁺ T细胞集中于脱髓鞘区并部分与巨噬细胞重叠；Ccr2^?/?小鼠巨噬细胞浸润显著减少且更稀疏，CD4⁺ T细胞数量急剧下降且不再与巨噬细胞共定位。结论为CCR2缺陷不仅改变浸润免疫细胞数量，还重塑脊髓中巨噬细胞和CD4⁺ T细胞的空间组织。

讨论部分总结：该研究通过整合临床CSF、公共单细胞转录组和Ccr2敲除双模型，系统揭示CCL2-CCR2通路在创伤性和自身免疫性CNS疾病中的差异机制。SCI中CCL2-CCR2激活主要集中于急性期，呈“快速、短期、主要先天免疫”特征；MS患者CSF CCL2水平常与疾病阶段和治疗相关且变异较大，可能被复杂慢性免疫调节网络抵消。单细胞分析显示SCI主要是粒细胞和巨噬细胞快速短时聚集，EAE核心驱动为致病CD4⁺ T细胞持续浸润和激活，并依赖辅助性T细胞1（Th₁）和辅助性T细胞17（Th₁₇）及后续单核细胞增殖迁移。CCR2在SCI浸润巨噬细胞中急性短暂上调后快速下降，而在EAE浸润单核细胞和CD4⁺ T细胞中持续高表达。Ccr2敲除在SCI中减少急性巨噬细胞浸润，但不显著改善急性行为，仅在21 dpi、28 dpi慢性期显示较好运动功能和组织保护，且CD4⁺ T细胞显著增加，类似现象在SCI模型中少有报道。EAE中CCR2缺失产生贯穿全程的显著保护，包括临床评分几近消失、脱髓鞘显著减少和炎症细胞浸润整体抑制，说明MS/EAE对CCR2依赖稳定。研究局限性包括部分患者亚组尤其MS样本量较小，鼠与人免疫系统存在差异，聚焦CCL2-CCR2可能忽略其他趋化因子和受体，且未涉及性别或年龄对免疫细胞行为的影响。空间免疫荧光进一步揭示CCR2在调节“细胞浸润”和“细胞分布”中的双重作用。差异可能反映急性创伤与慢性自身免疫神经炎症不同的炎症微环境和屏障特性，塑造CCL2-CCR2信号时间和细胞特异性。
研究结论翻译：本研究表明，CCL2-CCR2信号轴在中枢神经系统病理中发挥根本不同的功能角色。在脊髓损伤中，该通路驱动先天免疫细胞的快速而短暂募集；在自身免疫神经炎症中，该通路维持适应性免疫群体的长期浸润。这些情境依赖动态进一步反映在CCR2抑制的差异治疗效应中：在急性损伤中收益有限，但在自身免疫病中具有强健保护。总体而言，研究人员的发现强调保守炎症通路的功能输出高度依赖疾病情境和时间阶段，突出为中枢神经系统疾病开发病理特异和阶段适配免疫调节策略的必要性。