通过调控RNA代谢、细胞应激反应及Rho GTPase信号通路，假马齿苋（Bacopa monnieri）减轻阿尔茨海默病病理改变：基于阿尔茨海默病细胞模型的磷酸化蛋白质组学见解

《Neurochemistry International》：Bacopa monnieri Attenuates Alzheimer’s Pathology by Modulating RNA Metabolism, Cellular Stress Responses, and Rho GTPase Signaling: Phosphoproteomic Insights from a Cellular Model of Alzheimer’s Disease

　　

• •
  阿尔茨海默病目前仅有对症治疗手段，尚缺乏可治愈该病的疾病修饰策略。
• •
  利用阿尔茨海默病的细胞模型和恢复模型探索疾病过程中的分子变化
• •
  定量磷酸化蛋白质组学揭示了与B. monnieri相关的神经保护机制
• •
  B. monnieri恢复了关键通路，包括RNA代谢、细胞对压力的反应、Rho GTPases信号传导以及RHOBTB2 GTPase循环
• •
  鉴定出CDK11B、CDK12、PRKAA1、PRPF4B、STK10、ROCK1和ROCK2等激酶作为B. monnieri的下游效应分子

引言

阿尔茨海默病（AD）是一种影响65岁以上人群的渐进性神经退行性疾病。AD是最常见的痴呆类型，由大脑各部位神经元的丧失引起，导致行为和认知功能受损（Crous-Bou等，2017）。AD的神经病理学特征包括在大脑区域（如新皮层、内嗅皮层和海马体）中异常神经炎性斑块和神经原纤维缠结（NFTs）的积累。神经炎性斑块和NFTs分别由高度不溶的淀粉样β蛋白（Aβ）和过度磷酸化的微管相关蛋白tau组成（Kumar等，2024）。淀粉样β蛋白在毛细血管壁、动脉和小动脉内的沉积可导致淀粉样脑血管病。这进而导致血管壁成分的分解，进一步损害血流并增加脑实质内出血的易感性（Cortes-Canteli等，2010）。

尽管AD是一个重要的公共卫生问题，但治愈AD的治疗策略仍然有限。目前可用于AD治疗的药物旨在缓解症状，包括两类药物，如胆碱酯酶抑制剂和N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂。虽然这些药物在管理认知功能障碍方面有效，但它们通常伴有严重的副作用，包括胃肠道紊乱、心动过缓、头晕和失眠（Ruangritchankul等，2021）。因此，需要副作用更少的疾病修饰治疗，传统替代药物也存在发展空间。阿育吠陀医学，印度传统医学体系，自古便将Bacopa monnieri（Brahmi）描述为一种具有益智作用的草药，用于治疗各种神经系统疾病（Pase等，2012；Russo和Borrelli，2005）。先前的研究报告称，Bacopa monnieri（B. monnieri）中的生物活性化合物，如bacosides、bacopasides、bacopasaponin和葫芦素，被认为通过其抗氧化特性保护神经元细胞免受氧化损伤（Simpson等，2015）。此外，B. monnieri的甲醇提取物通过自由基清除作用防止H₂O₂诱导的DNA损伤（Russo等，2003）。而且，在阿尔茨海默病转基因小鼠模型中施用B. monnieri提取物显示负责AD的β-淀粉样蛋白表达降低（Fatima等，2022）。先前的果蝇和AD细胞模型研究表明，B. monnieri通过调节与细胞周期再进入、凋亡、线粒体动力学、细胞外基质组织、白细胞介素-4和白细胞介素-13信号传导相关的信号通路提供神经保护（Deolankar等，2023；Palollathil等，2024）。我们对B. monnieri水提物的非靶向代谢组学分析鉴定了3439种非冗余代谢物，涵盖苯甲酰胺类、黄酮类、酚类、醌类和氢醌类。我们的分析还显示，携带这些代谢物的靶蛋白与各种与神经元调节、神经传递和疾病相关的信号通路有关（Parate等，2024）。少数磷酸化蛋白质组学研究已在小鼠和死后AD脑组织中开展，以鉴定改变的磷酸化蛋白和信号网络（Dammer等，2015；Di Domenico等，2011；Marttinen等，2019；Morshed等，2021；Triplett等，2016）。可用于疾病修饰策略的磷酸化蛋白和信号通路的信息目前尚未获取。因此，需要鉴定参与逆转AD病理过程的磷酸化蛋白。

基于质谱的定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学方法可用于鉴定疾病特异性的失调蛋白、激酶及其底物，以及药物对其的恢复作用（Deolankar等，2023；Karthikkeyan等，2021）。在本研究中，我们采用定量时序磷酸化蛋白质组学方法，鉴定AD体外模型中受B. monnieri调节的磷酸化蛋白。AD细胞系模型通过用Aβ₄₂肽的寡聚体形式处理分化的IMR32细胞来构建。从Aβ₄₂组和B. monnieri组中分离的蛋白经过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，以深入鉴定B. monnieri在神经保护中调节的磷酸化蛋白。

各章节摘要

试剂采购

β-淀粉样蛋白1-42肽（Aβ₄₂）（产品编号A-1163-2，r-Peptide，美国）；视黄酸（产品编号R2625）、胶原（产品编号C9791）、噻唑蓝四唑溴化物（MTT，产品编号M5655）、碘乙酰胺（产品编号I6125）和DL-二硫代苏糖醇（产品编号D9779）均购自Sigma-Aldrich，美国圣路易斯。Pierce BCA蛋白测定试剂盒（产品编号23225）、Pierce定量显色肽测定试剂盒（产品编号23275）、TMT 10plex试剂盒（产品编号90110）、High-Select? Fe-NTA磷酸肽富集试剂盒（产品编号A32992）、钛

B. monnieri中关键代谢物的鉴定

我们之前已使用一系列植物化学和抗氧化实验对该提取物进行了详细的化学表征，包括总抗氧化能力（TAC）、自由基清除活性、还原力测定，以及总黄酮和总酚含量的定量测定（Palollathil等，2024）。此外，我们还对B. monnieri粉末进行了全面的基于LC-MS/MS的代谢组学分析，通过该分析鉴定了多种特征性代谢物

讨论

近年来，关于B. monnieri及其对阿尔茨海默病（AD）潜在治疗作用的研究引起了广泛关注。研究表明，B. monnieri通过清除自由基保护神经元细胞免受氧化应激和DNA损伤（Chaudhari等，2017；Russo等，2003）。此外，它还已知具有认知益处，如防止认知障碍和改善学习和记忆（Raghav等，2006）。少数研究探讨了

结论

本研究旨在阐明AD中受B. monnieri调节的时序磷酸化动态。我们的分析表明，B. monnieri的神经保护效果可能通过调节mRNA剪接以及与Rho GTPase信号通路的相互作用来实现。B. monnieri影响Rho GTPase的下游效应分子，如ROCK1和ROCK2，以恢复其磷酸化状态并防止Aβ₄₂处理导致的神经元细胞骨架紊乱。通过

CRediT作者贡献声明

Mohd. Altaf Najar：方法学、调查研究、形式分析。Ravishankar Pervaje：撰写——审阅与编辑、资源。Rajesh Raju：撰写——审阅与编辑、形式分析、数据管理。Thottethodi Subrahmanya Keshava Prasad：撰写——审阅与编辑、监督、资源、概念构思。Prashant Kumar Modi：撰写——审阅与编辑、监督、资源、项目管理、概念构思。Akhina Palollathil：撰写——初稿、可视化、验证，

伦理声明

作者未从参与者或其法律代表处获得知情同意。本研究不涉及人类参与者、人类生物材料的收集或可识别人类数据的获取。

本研究在研究开展地遵守了相关法律、法规框架和指南。根据相关法律和机构指南，无需获得伦理委员会批准。涉及的研究无需获得伦理批准。

作者披露声明

所有作者均已阅读并批准了稿件的最终版本，并声明不存在利益冲突。

数据和材料可用性

通过LC-MS/MS分析获得的原始数据已提交至蛋白质组交换联盟（http://proteomecentral.proteomexchange.org），通过PRIDE存储库，数据集标识符为PXD051558。

伦理批准

本研究已获机构科学审查委员会批准（YRC SRB/028/2019）。

资助信息

本研究未获得任何资助。

利益冲突声明

? 作者声明不存在已知的竞争性经济利益或个人关系，这些可能被认为影响了本报告中所述的工作。

致谢

我们感谢Yenepoya（被认为是一所大学）提供基础设施支持，包括质谱设施。我们还感谢印度政府生物技术部通过"基于质谱的代谢组学技术技能发展BIC"项目为Yenepoya（被认为是一所大学）提供基础设施支持。Akhina Palollathil曾获印度政府大学拨款委员会（UGC）的高级研究奖学金。

Akhina Palollathil|Mohd. Altaf Najar|Ravishankar Pervaje|Rajesh Raju|Thottethodi Subrahmanya Keshava Prasad|Prashant Kumar Modi