验证蝙蝠翅膜活检用于血液传播病原体检测与特征分析——基于吸血蝠（Desmodus rotundus）配对血液与翅组织的分子筛查

《Molecular Ecology》：Validating Wing Biopsies for Blood-Borne Pathogen Characterization in Bats

　　

野生动物监测对于追踪疾病出现、表征病原体多样性和评估溢出风险至关重要。由于血液传播病原体具有全球分布、宿主分类群广泛和人畜共患潜力，在这类工作中尤其受关注。尽管需要监测血液传播病原体，但采集血液对生物学家和采样的野生动物而言成本高昂（即耗时且造成应激），阻碍了扩展监测工作的能力。使用血管组织检测感染可最大限度减少采样工作和对野生动物的应激，但从这些组织进行病原体检测和表征与血液相比尚不清楚。为评估使用血管组织检测野生动物血液传播病原体的可靠性，研究人员从普通吸血蝠（Desmodus rotundus）采集了血液和翅膜活检的配对样本，并对巴尔通体（bartonellae）、血营养支原体（hemotropic mycoplasmas，hemoplasmas）和锥虫（trypanosomes）进行了分子筛查。所有病原体在翅组织中的检测概率均低于血液，可能是由于采集前者时避开血管。然而，研究人员在每种病原体中至少在两只个体蝙蝠的翅组织中检测到感染。配对阳性个体大多显示组织间高度序列一致性，检测单一感染所需的样本量和观察到的流行率相似（即 n = 10–39）。由于翅组织中感染概率低于血液，研究人员建议使用这些样本估计血液传播病原体的感染流行率并不理想。然而，结果表明血管组织可用于初步病原体评估和发现，以帮助未来靶向监测工作。

论文解读：验证蝙蝠翅膜活检用于血液传播病原体特征分析

一、研究背景与问题
野生动物病原体监测对追踪疾病出现、表征病原多样性及评估溢出风险至关重要。血液传播病原体（blood-borne pathogens，指通过血液传播、可感染多种宿主的病原体）因全球分布、宿主类群广和人畜共患潜力而受关注。传统监测通常依赖血液样本，但采集血液耗时、需专门训练并对野生动物造成显著应激；脾、肝、心等高度血管化器官组织虽可检测感染，却常需致死采样，涉及保护、许可和与其他研究冲突。耳夹、耳活检、趾夹、翅组织等血管组织（vascular tissues，富含血管的组织）采样更省力、非致死、微创，且博物馆常存档组织，但尚不清楚其与直接采血相比在血液传播病原体检测和鉴定中的可靠性。蝙蝠与巴尔通体（bartonellae，一类立克次体目细菌）、血营养支原体（hemotropic mycoplasmas，hemoplasmas，感染红细胞等组织的支原体）和锥虫（trypanosomes，原生动物鞭毛虫）等人畜共患血液病原体相关。蝙蝠翅膜高度血管化，翅活检（wing biopsies，从翼膜取下的组织样本）常用于分子物种鉴定、稳定同位素、种群结构、衰老和组学研究，但作为血液替代或互补样本用于监测尚不明确。因此，研究人员用普通吸血蝠（Desmodus rotundus）配对血液和翅活检，评估两种样本对三种病原感染检测的一致性。研究人员假设，由于采集翅活检时通常避开可见血管且全血量较少，翅组织中检测感染的概率低于血液。

二、研究概况与结论意义
研究人员在伯利兹采集63只普通吸血蝠的配对血液和翅组织，分子筛查巴尔通体、血营养支原体和锥虫，并用统计模型比较检测概率、评估序列一致性及计算所需样本量。结果表明，翅组织中三种病原检测概率均显著低于血液，但每种病原至少在两只蝙蝠翅组织中检出；配对阳性个体中组织间序列多高度一致，检测单一感染和观察流行率所需样本量相似（n = 10–39）。因此，用翅组织估计血液传播病原体感染流行率不理想，但翅组织可用于初步病原评估和发现，帮助指导未来更靶向的监测。该研究为减少采样努力和野生动物应激、利用已有及博物馆翅组织样本开展血液传播病原体发现提供了依据。

三、关键技术方法
样本队列来源于2021年11月和2022年4—5月伯利兹Orange Walk District的Lamanai Archeological Reserve和Ka'Kabish Archaeological Site；以雾网和竖琴网捕获普通吸血蝠（Desmodus rotundus），获得63只个体的配对血液和翅活检。血液保存于FTA卡，翅组织保存于DNA/RNA Shield。DNA提取采用两种方法。分子筛查用巢式PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链反应）靶向gltA（340 bps）检测巴尔通体、SSU rRNA（650 bps）检测锥虫，PCR靶向16S rRNA检测血营养支原体；扩增子纯化后Sanger测序，经BLASTn和已有方案分配基因型。统计拟合二项广义线性混合模型（generalized linear mixed model，GLMM），以个体蝙蝠和提取方法为随机效应，进行II型方差分析、估计边际均值、比值比（odds ratio，OR），并计算95%置信水平和80%统计功效下所需样本量。

四、研究结果
3 结果
在63只筛查蝙蝠中，60只筛查巴尔通体、60只筛查锥虫、62只筛查血营养支原体。49只巴尔通体阳性（82% [70%, 89%]；48只血阳性，3只翅阳性），38只血营养支原体阳性（61% [49%, 72%]；33只血阳性，9只翅阳性），26只锥虫阳性（43% [32%, 56%]；24只血阳性，2只翅阳性）。两只个体在血液和翅组织中均巴尔通体阳性，五只均血营养支原体阳性。分别有1、4、1只蝙蝠仅在翅组织中检出巴尔通体、血营养支原体和锥虫。14只蝙蝠共感染三种病原，其中2只若不用翅组织筛查则不会被发现；1只仅共感染巴尔通体和锥虫。配对阳性个体中，巴尔通体序列在血液和翅组织间100%相似；血营养支原体序列平均98.66% ± 0.54%相似，部分配对基因型一致，部分不一致。锥虫虽在两只个体翅组织检出，但无配对阳性，因此未纳入遗传一致性分析。
血液与翅组织检测概率比较显示，三种病原在翅组织中的检测概率均低于血液。巴尔通体翅组织检测概率0.05 [0.02, 0.14]，血液0.77 [0.65, 0.86]，翅组织检测可能性低98%（OR = 0.02，p < 0.0001，R²m = 0.57，R²c = 0.57）。血营养支原体翅组织0.15 [0.05, 0.38]，血液0.69 [0.38, 0.89]，翅组织低92%（OR = 0.08，p < 0.0001，R²m = 0.28，R²c = 0.41）。锥虫翅组织0.03 [0.01, 0.12]，血液0.39 [0.27, 0.51]，翅组织低95%（OR = 0.05，p = 0.0001，R²m = 0.40，R²c = 0.40）。
样本量估计表明，在80%统计功效和95%置信水平下，翅组织检测单一感染所需最低样本量分别为巴尔通体31、血营养支原体10、锥虫32；血液分别为1、2、3。检测观察流行率5%（巴尔通体）、15%（血营养支原体）、5%（锥虫）所需样本量分别为39、13、39。

五、讨论与结论
讨论部分指出，病原发现和监测对预测和管理新发传染病关键，捕获和采样野生动物耗时、费力且对动物造成应激，因此需要低采样努力、低应激的方法。研究人员在配对血液和翅组织中检测到血液传播病原体，证明翅组织是生物学相关的样本类型，比采血对蝙蝠应激更小。翅组织检测概率显著低于血液，但仍是初步病原检测和遗传表征的互补选择。六例感染仅通过翅组织筛查发现（1例巴尔通体、4例血营养支原体、1例锥虫），研究人员认为这可能源于组织内血液而非翅组织本身趋向性。讨论将检测概率与其他研究比较，例如巴西17只Desmodus rotundus中4只翅组织检出锥虫，美国俄克拉荷马361份Tadarida brasiliensis翅组织1份检出。翅组织病原序列通常与同一个体血液序列匹配，提示检测到相同感染。翅组织易于大量采集，常用于分子物种鉴定、稳定同位素、种群结构、衰老和组学研究，也常存入博物馆，未来可比较乙醇、福尔马林固定、硅胶、DNA/RNA Shield等保存方法。研究人员建议翅组织用于初步筛查，判断可能循环的血液传播病原体，再决定是否需采血进行更准确流行率估计和遗传变异表征。两种翅组织DNA提取方法中，Quick-DNA Miniprep Plus Kit的平均DNA浓度高0.02 ng/μL，但纯度无差异，巴尔通体和锥虫感染阳性无差异；血营养支原体用Quick-DNA/RNA Viral Magbead Kit提取时阳性可能性高86%，研究人员认为更可能源于试剂盒样本量不平衡和翅组织中血营养支原体感染稀有。感染检测差异可能与病原体趋向性有关：巴尔通体感染红细胞和血管内皮壁，血营养支原体为红细胞内感染（也可感染生殖组织），锥虫在哺乳动物宿主中有多样组织趋向性。因此翅组织检测更适合病原发现而非一般监测和流行率估计。所需样本量可为未来病原发现提供参考。
结论翻译：总之，研究人员表明，使用蝙蝠翅组织进行初步病原评估和发现，是蝙蝠血液的一种互补且侵入性更低的采样替代方案。尽管在翅组织中检测血液传播病原体可能不适用于估计感染流行率，但采集野生蝙蝠翅组织用于初步病原评估和发现，可帮助指导更具靶向性和纵向的监测工作。研究人员建议蝙蝠生物学家开始将翅组织纳入血液传播病原体检测和发现的工作流程，包括博物馆凭证保存和存档的样本。这样，使用互补的翅组织进行血液传播病原体检测将扩展研究人员对野生动物病原体多样性和溢出风险的基本认识。