精神分裂症小鼠模型中线粒体呼吸链及质量控制蛋白标志物的变化

《Mitochondrion》：Changes in protein markers of the mitochondrial respiratory chain and quality control in a mouse model of psychosis

　　

# 摘要

在中枢神经系统中，线粒体功能改变和线粒体质量控制（MQC）异常已持续与神经疾病相关联，但在精神障碍中的研究却相对较少。我们在一种模拟精神分裂症部分特征的神经发育小鼠模型中，测量了参与氧化磷酸化和线粒体质量控制的线粒体蛋白水平。我们使用了成年雌雄小鼠，其母鼠在妊娠期接受毒物甲基叠氮甲醇（MAM）暴露（腹腔注射给妊娠母鼠，妊娠第15至17天每日一次，剂量为10 mg/kg）。该处理导致成年后代出现运动活动异常、社交互动异常、新异物体识别障碍以及声惊吓前脉冲抑制异常。MAM处理的小鼠表现出线粒体呼吸链复合体I和复合体IV蛋白的性别二态性变化，以及参与线粒体融合和分裂的蛋白变化（分别为线粒体融合素1和-2、动力蛋白相关蛋白1）、线粒体自噬（PTEN诱导激酶1、Rab5和Rab7a）和线粒体生物发生（过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α、核呼吸因子1和-2、线粒体转录因子B2）的变化。据我们所知，这是首项在精神分裂症临床前模型中系统研究线粒体蛋白的研究，我们的数据为深入调查MAM处理小鼠（雌雄双性）的线粒体形态和功能奠定了基础。

## 1. 引言

线粒体是一把双刃剑，因为它们既是活性氧的主要来源，又可能在线粒体内容物（如凋亡激活因子、线粒体DNA/RNA和甲酰化蛋白）转移至胞质时触发细胞死亡和固有免疫机制（Flores-Romero等，2023年）。因此，细胞已发展出精细调节的线粒体控制机制（称为"线粒体质量控制"或MQC），包括线粒体自噬（如功能障碍线粒体的降解）、线粒体融合与分裂、线粒体生物发生以及线粒体囊泡的形成（Misgeld和Schwarz，2017年；Ge等，2020年；Harrington等，2023年）。多个由核基因编码的蛋白协同调控MQC过程，包括optineurin、NDP52、RabGEF1、Rab5和Rab7a（线粒体自噬）、DRP1（分裂）、线粒体融合素1和2（MFN1和-2）及OPA1（融合）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）、核呼吸因子1和2（NRF1和-2）以及线粒体转录因子TFAM、TFB1M和TFB2M（线粒体生物发生）。PTEN诱导蛋白激酶1（PINK-1）及其靶蛋白parkin——两种与单基因帕金森病相关的蛋白——位于上述许多过程的上游，调控线粒体自噬以及线粒体分裂、融合和生物发生（Ge等，2020年；Harrington等，2023年）。不出所料，线粒体功能障碍和MQC异常已被认为与慢性神经退行性疾病的神经元退变和低度炎症机制有关，如帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、弗里德reich共济失调和开角型青光眼（Ge等，2020年；Harrington等，2023年；Collier等，2023年；Stavropoulos等，2023年；Tong等，2026年）。因此，靶向MQC的药物已被提出作为慢性神经退行性疾病潜在的疾病修饰剂（Kang，2020年；Martucci等，2025年）。其中一些药物已上市，如omaveloxolone和二甲基马来酸酯（DMF），分别用于治疗弗里德reich共济失调和多发性硬化症（Indelicato等，2025年；Zhao等，2026年），以及吡咯喹啉醌（PQQ），用于治疗开角型青光眼并作为认知增强剂（Martucci等，2025年；Tamakoshi等，2023年；Ikemoto等，2024年）。所有这些药物通过不同机制促进线粒体生物发生，最终汇聚于诱导和/或激活PGC-1α（Chowanadisai等，2010年；Zhang，2015年；Hayashi等，2017年；Gureev等，2019年；Devasani等，2020年；Jonscher等，2021年；Dayalan Naidu和Dinkova-Kostova，2023年；Bresciani等，2023年；Charrier等，2024年；de Oliveira，2026年）。

越来越多的证据表明，线粒体功能障碍也参与精神障碍的病理生理过程，包括精神分裂症（Papageorgiou和Filiou，2024年）。在精神分裂症患者中，前额叶皮层（PFC）和前扣带回皮层中的线粒体密度、OPA1和MFN2水平均降低（Rosenfeld等，2011年；Somerville等，2011年；Barksdale等，2014年；Roberts等，2015年；Uranova等，2018年）。此外，线粒体呼吸链复合体I的异常已持续与精神分裂症相关联，并与多巴胺能传递变化呈双向联系（Ben-Shachar，2002年；Karry等，2004年；Akarsu等，2014年；Ben-Shachar，2017年；Holper等，2019年；Haghighatfard等，2022年；Ricci等，2026年）。有趣的是，有研究报告未经药物治疗的精神分裂症患者外周血白细胞中编码PGC-1α、parkin和LC3B（一种参与线粒体自噬的蛋白）的基因表达降低，提示线粒体功能障碍与精神分裂症之间存在因果关系（Lo等，2023年；Chu等，2024年）。

目前缺乏的是一项在能再现精神病行为表型的临床前模型中系统研究参与线粒体功能和MQC的蛋白的研究。在此，我们使用了妊娠期母鼠接受毒物甲基叠氮甲醇（MAM）处理的子代。MAM模型在大鼠中已被充分表征，作为精神分裂症模型具有表面效度（Cattaneo等，1995年；Moore等，2006年；Jones等，2011年）。然而，该模型缺乏构念效度，因为MAM会导致广泛的神经元迁移异常，而在精神分裂症患者的死后研究中并未观察到这些异常（Baraban和Schwartzkroin，1996年；Muraki和Tanigaki，2015年）。

MAM暴露的子代表现出对精神兴奋剂的运动反应增强、前脉冲抑制（PPI）受损、社交行为和认知功能缺陷（Moore等，2006年；Flagstad等，2004年；Le Pen等，2006年；Hazane等，2009年）。在小鼠中，产前MAM暴露会在成年雌雄子代中诱导精神分裂症样症状和组织学改变。然而，虽然海马功能在雌雄子代中均受损，但只有雄性表现出依赖PFC的行为缺陷（Chalkiadaki等，2019年）。一篇最近的综述详细阐述了生物性别和性激素对线粒体功能和MQC的影响（Bynum和Edwards，2026年）。雌性组织表现出偏向融合的线粒体网络（如MFN1、MFN2和OPA1的表达/活性增加）以及更强的抗氧化能力（第二型超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽水平增加）（Borrás等，2003年；Tarnopolsky，2008年；Lagranha等，2010年），而雄性组织则表现出偏向分裂的线粒体网络（线粒体碎片化增加及DRP1表达/活性增加）以及更大的氧化应激易损性（Cicali等，2025年；Springer-Sapp等，2025年）。此外，雌激素支持线粒体生物发生，而雌激素缺乏会损害线粒体自噬；睾酮则支持线粒体呼吸链活性，低睾酮水平会降低线粒体生物发生（Bynum和Edwards，2026年）。

在此，我们检测了产前暴露于MAM的成年雌雄小鼠前额叶皮层和海马中线粒体呼吸链蛋白（复合体I至IV及ATP合酶）和MQC相关蛋白（PGC-1α、NRF1、NRF2、TFB2M、MFN1、MFN2、OPA1、DRP1、PINK-1、optineurin、Rab5和Rab7a）水平的变化。

## 2. 材料与方法

### 2.1. 试剂

蛋白酶抑制剂混合物（sc-29,130，ChemCruz），磷酸酶抑制剂混合物（货号04906837001，Roche），Bradford试剂（#5000006，Bio-Rad），Clarity Western ECL（#170-5060，Bio-Rad）。甲基叠氮甲醇乙酸酯（MAM）购自D.B.A.（米兰，意大利）。

### 2.2. 动物与处理

成年雄性C57/Bl6J小鼠（体重22-24 g，Charles River，Calco，LC，意大利）在标准控制条件下饲养：12小时光/暗周期，温度23 ± 2°C，湿度45 ± 15%，自由摄食饮水。一切努力旨在最小化实验动物用量。所有实验操作均符合意大利（D.L. 26/2014）和欧盟指令（2010/63/EU）关于实验动物保护的规定。本研究经Sapienza大学和IRCCS Neuromed的动物福利机构（OPBA）及意大利卫生部批准（批准号：481/2025-PR和44/2025-PR）。为诱导精神分裂症相关表型，妊娠母鼠在妊娠第15至17天每日接受腹腔注射甲基叠氮甲醇乙酸酯（MAM，10 mg/kg）或生理盐水（100 μl）（Takahashi等，2019年）。子代于出生后第21天断奶，随后根据性别、年龄和处理条件（生理盐水或MAM）分笼饲养。每项分析分别使用不同窝次的动物：生化分析每处理组（生理盐水和MAM）4窝，行为分析每处理组7窝。所有配对使用一雄两雌的繁殖比例。行为评估于出生后第74至80天进行，随后处死动物以进行生化分析。

### 2.3. 行为测试

为减少操作相关应激，在首次行为测试之前，通过多次操作会话使小鼠逐个习惯实验者。测试当天，将小鼠转移至行为测试室，至少适应环境30分钟后再开始实验。所有测试均在12小时光/暗周期的光期进行，并在处死前一周内完成。

### 2.4. 旷场实验

旷场实验用于评估开阔场迷宫（42 × 42 × 21 cm，顶部开放，聚苯乙烯板壁）中焦虑相关行为和活动能力，环境光条件为暗光（25 lx）。迷宫连接至配备红外传感器的活动监测仪，使用EthoVision XT10追踪软件进行分析。将小鼠逐个放置在迷宫中心，自由探索5分钟。记录在装置中移动的距离、在中央区域停留的时间、平均速度和刻板行为，由计算机化分析系统记录（旷场活动系统硬件；Med Associates, Inc.，St. Albans，英国）。每次测试之间用70%乙醇溶液清洁迷宫并晾干数分钟。

### 2.5. 新异物体识别（NOR）实验

该实验在与旷场实验相同的环境条件下进行。使用开放式迷宫（45 × 30 × 30 cm）进行为期三天的方案评估识别记忆。实验分为习惯化、熟悉化和测试三个阶段，分别在连续三天进行。第1天（习惯化）：将小鼠逐个放入空迷宫中，自由探索5分钟，使其熟悉环境。本次实验中不放置任何物体。第2天（训练/熟悉化）：在迷宫中对角对称放置两个形状、颜色和气味相同的物体，每只小鼠自由探索物体10分钟。探索行为定义为鼻尖朝向物体且距离≤2 cm和/或用鼻尖触碰物体。坐在物体上或从物体旁经过不视为探索行为。与物体互动时间少于20秒的动物从分析中排除（Leger等，2013年；Tropea等，2022年）。第3天（测试）：将一个熟悉物体替换为形状和外观不同但大小相似的新异物体。将小鼠重新放入迷宫，允许其探索5分钟。记录探索熟悉物体和新异物体的时间。通过计算识别指数（RI）评估识别记忆，定义为探索新异物体时间与总探索时间（新异+熟悉）的比值。

每次测试之间用70%乙醇溶液清洁迷宫和物体并晾干，以消除嗅觉线索。所有实验均录制视频，并使用ANYmaze（Stoelting Co.，美国，版本7.4）进行分析。

### 2.6. 社交互动（SI）实验

社交互动采用金属网格笼范式进行评估，如参考文献所述（Liu等，2012年），其中陌生小鼠被限制在金属网格笼内，仅允许感觉接触（嗅闻）。社交行为在开放式迷宫（45 × 30 × 30 cm）中评估。测试前，小鼠先适应测试迷宫和金属网格笼8分钟。习惯化结束后，将一只年龄、性别和品系匹配的陌生小鼠引入迷宫中并置于金属网格笼内，作为社交刺激（入侵者）。使用数码相机记录2分30秒内与陌生个体的直接互动时间（嗅闻、距离2 cm以内的接近），并进行盲评评分。入侵者不属于实验组，仅作为社交伙伴使用。

为最大限度地减少行为反应的变异性，社交刺激小鼠每天最多用于两个实验session，并在session之间留有充足的恢复时间。2.7 前脉冲抑制（PPI）测试使用意大利Ugo Basile的设备进行。将小鼠单独放入放置在配备磁换能器的平台上的有机玻璃限制器中，并置于隔音室内。刺激呈现和数据采集通过Startle PPI软件（版本2.1）控制，该软件根据操作员定义的方案传递脉冲和前脉冲刺激，并记录相应的惊跳反应以供后续分析。实验方案基于先前已发表的程序，并根据研究的具体要求进行修改（Sterneck等，1998；Matrisciano等，2013；Kobayashi等，2021）。在5分钟的连续65 dB白噪背景适应期后，进行PPI测试部分。在session的开始和结束各呈现五个120 dB惊跳脉冲（宽带噪声，30毫秒），以评估基线惊跳反应性。主要测试session持续约30-40分钟，由60个试次组成，以伪随机顺序呈现，每个条件10个试次：（i）无刺激试次；（ii）单个120 dB惊跳脉冲，30毫秒；以及惊跳前脉冲试次，包含（iii）74 dB、（iv）78 dB、（v）82 dB和（vi）90 dB的前脉冲，时长20毫秒。前脉冲起始与惊跳脉冲起始之间的间隔为100毫秒。惊跳振幅定义为脉冲呈现后100毫秒时间窗口内检测到的最大反应。试次间平均间隔（ITI）设为15秒。抑制程度的计算使用以下比值：%PPI = 100 × [1 ? (PP / P)]，其中P为对单独惊跳脉冲的平均反应振幅，PP为前脉冲先于脉冲时（前脉冲+脉冲）的平均反应振幅。session之间，用70%乙醇溶液清洁笼具。2.8 Western blot分析小鼠经断头处死，大脑迅速冷冻并储存在?80°C。随后解剖出前额叶皮层和海马，在冰冷的Triton X裂解缓冲液中（10 mM Tris–HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，1% Triton X-100，1 mM EDTA，10%甘油，添加完整蛋白酶抑制剂混合物和PhosSTOP）（Roche, Meylan, 法国）在4°C下超声匀浆。在4°C、13,000 x g离心30分钟后，10-15 μg蛋白质重悬于含有5% 2-巯基乙醇的十二烷基硫酸钠（SDS）-溴酚蓝还原缓冲液中，在100°C水浴中孵育5分钟上样，OXPHOS除外。样品通过4-20% Mini-PROTEAN TGX预铸蛋白凝胶进行SDS-PAGE电泳分离，然后使用Trans-Blot Turbo Mini（Bio-Rad）转印到PVDF膜上。Western blot在含0.1% Tween-20（Sigma-Aldrich）和5%脱脂奶粉（Bio-Rad）或2% BSA的溶液中于室温封闭1小时。随后在4°C下与以下一抗孵育过夜：OXPHOS（1:1000，ab110413，Abcam, Cambridge, UK）；PGC-1α（1:5000，#66369-1-Ig，Proteintech）；NRF1（1:5000，NBP2-19586，Novus Biological）；NRF2（1:800，NBP1-32822，Novus Biological）；TFB2M（1:500，24411-1-AP，Proteintech）；OPA1（1:1000，NB110-55290，Novus Biological）；MFN1（1:1000，AB221661，Abcam）；MFN2（1:5000，12186-1-AP，Proteintech）；DRP1（1:1000，NB110-55288ss，Novus Biological）；PINK1（1:5000，81991-4-RR，Cell Signaling）；OPTN（1:3000，10837-1-AP，Proteintech）；Rab5（1:5000，ab109534，Abcam）；Rab7a（1:2000，55469-1-AP，Proteintech）；GAPDH（1:1000，Sc-32,233，Santa Cruz）。免疫反应条带通过增强化学发光（使用辣根过氧化物酶偶联的二抗，1:7000，Millipore）进行显影。尽可能时，不同抗体在膜上依次孵育，同时考虑目标蛋白的不同分子量以及所用抗体的非特异性结合。所有前额叶皮层和海马的Western blot分别显示在图7和图8中，展示了每张膜所用免疫反应条带的结果。Western blot图像的定量分析使用ImageJ软件（NIH, Bethesda, MD, 美国）进行密度分析。3. 结果a) 产前暴露于MAM后成年小鼠的行为表型行为分析从出生后第（PND）74天到78天连续进行5天，顺序如下：PND74进行开敞场装置中的运动活动、冒险行为和刻板行为，PND75和76进行新物体识别（NOR）测试，PND77进行社会交互测试，PND78进行听觉惊跳的前脉冲抑制（PPI）测试（图1A）。开敞场中的运动活动评估显示，MAM暴露使两种性别的速度均增加，但移动距离未改变（图1B,C）。雌性在场地中心停留时间较少（即表现出更多的焦虑样行为），MAM暴露对两种性别均无影响（图1D）。雌性刻板行为持续时间和刻板行为发作次数均显著低于雄性，MAM暴露无影响（图1E,F）。在NOR测试中，对照雌性的识别指数低于对照雄性。MAM暴露降低了雄性的识别指数，对雌性无影响（图2A）。在社会交互测试中，对照雌性探索入侵者的时间少于对照雄性，MAM暴露降低了两种性别的社会交互（图2B）。在PPI测试中，对照雄性和雌性之间无差异。MAM大幅降低了PPI百分比（图2C,D）。这些结果表明，在我们的实验条件下，产前MAM暴露导致两种性别的成年小鼠出现与精神分裂症相关的表型。b) MAM暴露小鼠前额叶皮层和海马中线粒体呼吸链蛋白复合体的性别依赖性变化下载：下载高分辨率图像（608KB）下载：下载全尺寸图像图1. 处理和性别对开敞场和刻板行为分析中行为表现的影响。A）行为评估实验设计的流程图。B-F）开敞场测试。数据为每组12-19只小鼠的均值±SEM。使用Grubbs检验排除个体异常值，导致样本量（n）变化。符号表示统计学显著性差异（*与各自生理盐水组比较；#性别差异；p < 0.005）。速度和移动距离数据使用双因素方差分析进行分析。对于速度（B），观察到处理显著效应（生理盐水 vs MAM，F (1, 52)=16.95 p < 0.0001），而性别（F (1, 52)=4.973 p = 0.0301）和交互作用（F (1, 52)=0.2494 p = 0.6196）效应不显著。对于移动距离（C），性别效应显著（F (1, 54)=4.683 p = 0.0349），但处理（生理盐水 vs MAM，F (1, 54)=0.1169 p = 0.7337）和交互作用（F (1, 54)=0.02293 p = 0.8802）效应不显著。D）中心停留时间使用Kruskal-Wallis检验后进行Dunn事后检验分析，n = 60；H (3)=30.09；p < 0.0001。E-F）刻板行为分析：刻板行为持续时间与频率使用双因素方差分析进行分析。对于持续时间（E），性别效应显著（F (1, 56)=56.24 p < 0.0001），但处理（生理盐水 vs MAM，F (1, 56)=1.595 p = 0.2118）和交互作用（F (1, 56)=0.4695 p = 0.4960）无显著效应。同样，对于刻板行为发作次数（F），仅性别效应显著（F (1, 55)=66.44 p < 0.0001），处理（生理盐水 vs MAM，F (1, 55)=0.03710 p = 0.8480）和交互作用（F (1, 55)=0.1542 p = 0.2196）无显著效应。下载：下载高分辨率图像（627KB）下载：下载全尺寸图像图2. MAM处理小鼠的识别记忆、社会行为和感觉运动门控（PPI）评估。数据以均值±SEM表示。p < 0.005（*与各自生理盐水组比较；#性别差异）。A）新物体识别（NOR）测试：训练试次中总探索时间低于20秒的小鼠（n = 12-19）被排除在分析之外，最终样本量为n = 7-15。双因素方差分析显示处理和性别之间存在显著交互作用（F (1, 39)=6.675 p = 0.0136），而处理主效应（生理盐水 vs MAM，F (1, 39)=1.469 p = 0.2328）和性别（F (1, 39)=2.719 p = 0.1072）均不具统计学显著性。B）社会交互：双因素方差分析（n = 12-19）显示处理（生理盐水 vs MAM，F (1, 53)=27.37 p < 0.0001）和性别（F (1, 53)=9.941 p = 0.0027）均有显著主效应，交互作用不显著（F (1, 53)=0.4768 p = 0.4929）。C）所有dB的PPI：数据为均值±SEM（n = 12-19）。74和82 dB数据使用双因素方差分析后进行Fisher's LSD事后检验（74 dB，处理：生理盐水 vs MAM，F (1, 57)=54.46 p < 0.0001；性别，F (1, 57)=0.2888 p = 0.5931；交互作用，F (1, 57)=0.8212 p = 0.3686；82 dB，处理：生理盐水 vs MAM，F (1, 57)=31.23 p < 0.0001；性别，F (1, 57)=1.458 p = 0.2322；交互作用，F (1, 57)=0.007146 p = 0.9329）。78和90 dB数据使用Kruskal-Wallis检验后进行Dunn事后检验分析（n = 61；78 dB：H (3)=31.57，p < 0.0001；90 dB：H (3)=37.62，p < 0.0001）。D）总PPI：数据使用Kruskal-Wallis检验后进行Dunn事后检验分析，n = 61；H (3)=37.62 p < 0.0001。包含所有PFC样品的免疫印迹图显示免疫反应条带分离清晰，复合体I/NFDUB8的预期分子量为20 kDa，复合体II/SDHB为30 kDa，复合体IV/MTCO1为40 kDa，复合体III/UQCRC2为48 kDa，复合体V/vATP5A为50 kDa（图3A）。灰度值见在图3B。对照雄性的复合体I、III和IV蛋白水平显著低于对照雌性。产前MAM暴露大幅增加了雄性复合体I和IV的蛋白水平，并降低了雌性复合体I水平。MAM暴露未改变两种性别的复合体II、III和IV（图3A,B）。下载：下载高分辨率图像（647KB）下载：下载全尺寸图像图3. 小鼠前额叶皮层中线粒体呼吸链复合体的改变。数据为均值±SEM（n = 7），使用双因素方差分析后进行Fisher's LSD事后检验分析。A）展示所有OXPHOS蛋白复合体及其对应分子量的代表性Western blot，以GAPDH作为上样对照。B）复合体I：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=5.737 p = 0.0248；性别，F (1, 24)=18.78 p = 0.0002；交互作用F (1, 24)=39.18 p < 0.0001。复合体IV：生理盐水 vs MAM F (1, 24)=13.91 p = 0.0010；性别，F (1, 24)=3.548 p = 0.0718；交互作用，F (1, 24)=14.39 p = 0.0009。复合体II：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=1.934 p = 0.1771；性别，F (1, 24)=1.569 p = 0.2224；交互作用，F (1, 24)=0.1627 p = 0.6903。复合体III：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=0.03233 p = 0.8588；性别，F (1, 24)=16.59 p = 0.0004；交互作用，F (1, 24)=7.331 p = 0.0123。复合体V使用Kruskal-Wallis检验后进行Dunn事后检验分析，n = 28；H (3)=5.685 p = 0.1280。海马中的数据相似但不完全相同，对照雄性的复合体I和IV蛋白水平低于对照雌性。MAM暴露大幅增强了雄性复合体I和IV的蛋白水平，但对雌性无影响。所有实验组间复合体II、III和V的蛋白水平无差异（图4A,B）。c) MAM暴露小鼠前额叶皮层和海马中线粒体质量控制蛋白水平的性别依赖性变化下载：下载高分辨率图像（636KB）下载：下载全尺寸图像图4. 海马OXPHOS复合体图谱。A）展示感兴趣蛋白复合体的代表性免疫印迹；以GAPDH作为上样对照。标注了分子量（kDa）。B）所有数据均使用双因素方差分析加Fisher's LSD事后检验分析，以均值±SEM表示（n = 7）。复合体I：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=9.739 p = 0.0046；性别，F (1, 24)=7.012 p = 0.0141；交互作用，F (1, 24)=13.36 p = 0.0013。复合体IV：生理盐水 vs MAM F (1, 24)=9.395 p = 0.0053；性别，F (1, 24)=5.786 p = 0.0242；交互作用F (1, 24)=3.422 p = 0.0767。复合体II：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=0.03430 p = 0.8546；性别，F (1, 24)=1.637 p = 0.2130；交互作用，F (1, 24)=0.002711 p = 0.9589。复合体III：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=2.343 p = 0.1389；性别，F (1, 24)=0.7305 p = 0.4012；交互作用，F (1, 24)=0.2135 p = 0.6482。复合体V：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=1.392 p = 0.2496；性别，F (1, 24)=4.840 p = 0.0377；交互作用F (1, 24)=2.438 p = 0.1315。对参与线粒体融合的蛋白进行免疫印迹分析，MFN1显示75 kDa的单一条带，MFN2显示88 kDa的单一条带，OPA1显示80-100 kDa的双条带（图7，图8）。在前额叶皮层中，对照雌性的MFN1水平低于对照雄性，MFN2和OPA1无性别相关差异。MAM暴露降低了雄性的MFN1并增强了雌性的MFN2水平（图5A）。在海马中，MAM处理导致雄性MFN2水平显著降低，对雌性无影响（图5B）。下载：下载高分辨率图像（489KB）下载：下载全尺寸图像图5. MAM处理对小鼠前额叶皮层和海马中线粒体融合与分裂的影响。数据以均值±SEM表示（n = 7）。统计学显著性通过双因素方差分析后进行Fisher's LSD事后检验确定，除非另有说明。

处理、性别及交互作用的统计结果如下：A) 前额叶皮层（PFC）中的融合蛋白：MFN1：生理盐水 vs MAM，F (1, 22)=2.684，p = 0.1156；性别，F (1, 22)=16.10，p = 0.0006；交互作用，F (1, 22)=1.685，p = 0.2077。MFN2：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=7.481，p = 0.0115；性别，F (1, 24)=5.685，p = 0.0254；交互作用，F (1, 24)=7.373，p = 0.0121。OPA1：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=1.212，p = 0.2819；性别，F (1, 24)=6.436，p = 0.0181；交互作用，F (1, 24)=1.156，p = 0.2930。B) 海马中的融合蛋白：MFN1采用Kruskal-Wallis检验后结合Dunn事后检验进行分析，(n = 26)；H (3)=2.633，p = 0.4518。MFN2：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=0.9291，p = 0.3447；性别，F (1, 24)=0.05187，p = 0.8218；交互作用，F (1, 24)=4.136，p = 0.0532。OPA1：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=0.04459，p = 0.8345；性别，F (1, 24)=4.969，p = 0.0354；交互作用，F (1, 24)=2.672，p = 0.1152。C) PFC中的分裂蛋白：PFC中的DRP1：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=8.865，p = 0.0065；性别，F (1, 24)=13.33，p = 0.0013；交互作用，F (1, 24)=3.707，p = 0.0661。D) 海马中的分裂蛋白：DRP1：生理盐水 vs MAM，F (1, 22)=3.398，p = 0.0788；性别，F (1, 22)=0.7944，p = 0.3824；交互作用，F (1, 22)=16.46，p = 0.00005。

作为线粒体分裂的生物化学标志物，DRP1在约75 kDa处检测为单一条带（图7，图8）。在PFC中，MAM暴露显著增强了雌性小鼠的DRP1水平（图5C）。在海马中，对照组雌性的DRP1水平低于对照组雄性，而MAM暴露使雄性小鼠的DRP1水平大幅降低（图5D）。

我们测量了optineurin、Rab5和Rab7a作为线粒体自噬的标志物，以及PINK-1作为线粒体自噬及其他线粒体质量控制（MQC）组分的主调控因子。Optineurin、Rab5、Rab7a和PINK-1分别在66–70、24、23和46 kDa处检测为单一条带（图7，图8）。在PFC中，optineurin水平未发生变化，而MAM暴露显著降低了雄性小鼠的Rab5水平，并大幅增强了雌性小鼠的PINK-1水平。对照组雌性的Rab7a水平高于对照组雄性，且MAM暴露显著降低了雌性小鼠的Rab7a水平（图6A）。在海马中，我们发现PINK-1水平存在显著的性别和MAM依赖性变化：对照组雌性的PINK-1水平明显低于对照组雄性，MAM暴露使雄性小鼠的PINK-1水平降低，而在雌性小鼠中则大幅升高（图6B）。对照组雌性的Rab5水平较低，且MAM暴露显著降低了雄性小鼠的Rab5水平。相反，Rab7a水平在雌性小鼠中因MAM暴露而显著降低（图6B）。

下载：下载高分辨率图像（999KB）
下载：下载全尺寸图像

**图6. 生理盐水和MAM处理的小鼠在前额叶皮层和海马中线粒体自噬与生物发生的评估。** 数据以均值±标准误（n = 6–7）表示。统计显著性通过双因素方差分析后结合事后检验确定（*p < 0.05，与相应的生理盐水组相比；# p < 0.05，性别差异），除非另有说明。前额叶皮层（A、C）和海马（B、D）中线粒体自噬和生物发生标志物的定量分析如下所示。每种蛋白的详细统计值列于下方。A) PFC中的线粒体自噬标志物：Pink1：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=15.80，p = 0.0006；性别，F (1, 24)=6.600，p = 0.0168；交互作用，F (1, 24)=13.74，p = 0.0011；OPTN：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=0.2809，p = 0.6010；性别，F (1, 24)=4.264，p = 0.0499；交互作用，F (1, 24)=1.098，p = 0.3052。Rab5：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=0.5719，p = 0.4569；性别，F (1, 24)=0.1858，p = 0.6703；交互作用，F (1, 24)=8.364，p = 0.0080；Rab7a：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=5.922，p = 0.0228；性别，F (1, 24)=0.8769，p = 0.3584；交互作用，F (1, 24)=6.055，p = 0.0214。B) 海马中的线粒体自噬标志物：Pink1：生理盐水 vs MAM，F (1, 23)=0.9336，p = 0.3440；性别，F (1, 23)=0.0002305，p = 0.9880；交互作用，F (1, 23)=33.16，p < 0.0001；OPTN：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=1.266，p = 0.2717；性别，F (1, 24)=1.918，p = 0.1788；交互作用，F (1, 24)=1.753，p = 0.1979；Rab5：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=0.5620，p = 0.4608；性别，F (1, 24)=2.330，p = 0.1399；交互作用，F (1, 24)=6.275，p = 0.0194；Rab7a：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=5.171，p = 0.0322；性别，F (1, 24)=0.07175，p = 0.7911；交互作用，F (1, 24)=2.426，p = 0.1324。C) PFC中的生物发生标志物：PGC-1α（n = 28）；H (3)=7.877，p = 0.0486。采用Kruskal-Wallis检验后结合Dunn事后检验进行分析。NRF1：生理盐水 vs MAM，F (1, 22)=0.3000，p = 0.5894；性别，F (1, 22)=0.3087，p = 0.5841；交互作用，F (1, 22)=23.77，p < 0.0001。NRF2：生理盐水 vs MAM，F (1, 22)=0.7952，p = 0.3822；性别，F (1, 22)=1.477，p = 0.2372；交互作用，F (1, 22)=0.8547，p = 0.3653。TFB2M：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=3.774，p = 0.0639；性别，F (1, 24)=2.152，p = 0.1554；交互作用，F (1, 24)=1.463，p = 0.2382。D) 海马中的生物发生标志物：PGC-1α：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=1.984，p = 0.1718；性别，F (1, 24)=10.80，p = 0.0031；交互作用，F (1, 24)=0.8116，p = 0.3766。NRF1：生理盐水 vs MAM，F (1, 22)=0.9116，p = 0.3501；性别，F (1, 22)=3.815，p = 0.0636；交互作用，F (1, 22)=0.4134，p = 0.5269。NRF2：生理盐水 vs MAM，F (1, 22)=3.574，p = 0.0719；性别，F (1, 22)=0.7789，p = 0.3870；交互作用，F (1, 22)=0.09457，p = 0.7613。TFB2M：生理盐水 vs MAM，F (1, 24)=0.7510，p = 0.3948；性别，F (1, 24)=1.676，p = 0.2078；交互作用，F (1, 24)=0.004061，p = 0.9497。

我们还测量了PGC-1α、NRF1、NRF2和TFB2M作为线粒体生物发生的生物化学标志物。PGC-1α、NRF2和TFB2M分别在100、55–68和50 kDa处检测为单一条带。NRF1在约50 kDa处检测为双重带（图7，图8）。在PFC中，对照组雌性的PGC-1α水平显著低于对照组雄性，而NRF1水平显著高于对照组雄性。MAM暴露降低了雄性小鼠的PGC-1α水平，降低了雌性小鼠的NRF1水平，并增强了雌性小鼠的TFB2M水平。NRF2在四组小鼠之间未显示差异（图6C）。在海马中，对照组雌性的PGC-1α水平低于对照组雄性，而其他所有线粒体生物发生标志物均无性别依赖性差异。MAM暴露对两性小鼠海马中的PGC-1α、NRF1、NRF2和TFB2M均无影响（图6D）。

下载：下载高分辨率图像（987KB）
下载：下载全尺寸图像

**图7. MAM暴露小鼠前额叶皮层中线粒体动态的性别特异性改变。** 前额叶皮层中线粒体标志物的Western blot图像。蛋白表达水平以GAPDH进行标准化。标示了相对分子量。

下载：下载高分辨率图像（813KB）
下载：下载全尺寸图像

**图8. 海马中线粒体动态在雄性和雌性小鼠中受到MAM的差异化影响。** 海马中线粒体标志物的Western blot图像。蛋白表达水平以GAPDH进行标准化。标示了相对分子量。

**4. 讨论**

本研究存在两个局限性：(i) 我们将分析限制在线粒体呼吸链酶复合体和MQC蛋白的表达水平上，未探究线粒体功能或形态；(ii) 由于行为分析和生化分析使用了不同组的小鼠，我们无法进行行为与线粒体蛋白之间的相关性分析。针对第一个局限性，我们计划在后续研究中根据生化数据进行高度聚焦的功能和形态学分析。针对第二个局限性，我们选择在不受行为测试序列偏差影响的情况下进行蛋白分析，因为行为测试可能导致线粒体功能和MQC发生变化。

我们产前暴露于MAM的小鼠表现出精神病相关表型，运动活动增加，且听觉惊跳的PPI（前脉冲抑制）降低。这些行为测试对抗精神病药物有反应（Powell和Miyakawa，2006；Castagné等，2009；Moore，2010；Van den Buuse，2010）。两性小鼠的MAM暴露均导致社交互动测试中的损害，这可能反映了一种阴性症状相关表型。相比之下，MAM暴露仅在雄性小鼠中导致NOR测试表现降低，尽管在雌性小鼠中，MAM的效果可能因NOR测试中的低表现而被掩盖。

线粒体蛋白分析揭示了模型相关和性别相关的差异。首先的分析聚焦于OXPHOS，测量了氧化磷酸化系统5个复合体的蛋白。NADH脱氢酶（泛醌）1β亚复合物亚基8（NDUFB8）是定位于复合体I膜间隙面的NADH脱氢酶亚基（Szklarczyk等，2011）。琥珀酸脱氢酶铁硫亚基B（SDHB）是呼吸链复合体II的组分，是连接三羧酸循环与OXPHOS的桥梁（Du等，2023）。细胞色素b-c1复合体亚基2（UQCRC2）是泛醇-细胞色素c还原酶即复合体III的亚基。MTOC1是细胞色素c氧化酶即复合体IV的亚基1，将分子氧还原为水（Sousa等，2018）。ATP5A是ATP合酶（复合体V）的亚基（Chaban等，2014；Neupane等，2019）。

两个脑区中NDUFB8和MTOC1的水平，以及PFC中UQCRC2的水平，在对照组雌性中均高于对照组雄性，提示复合体I、III和IV的OXPHOS蛋白表达受雌性性激素上调。这与雌激素诱导海马或全脑细胞色素氧化酶亚基（Bettini和Maggi，1992；Raval等，2012；Irwin等，2008），以及增强皮层星形胶质细胞中OXPHOS亚基表达（Araújo等，2008）的证据一致。

有趣的是，产前暴露于MAM对海马和PFC中的复合体I/NDUFB8和复合体IV/MTOC1蛋白水平产生了性别二态性效应，在雄性中增加水平而在雌性中降低水平。因此，MAM处理消除了对照组小鼠中复合体I和IV亚基表达所见的性别相关差异。在雄性中，复合体I/NDUFB8的大幅增加而复合体II和复合体III无变化，可能导致分子氧的单电子还原并形成超氧阴离子（Grivennikova和Vinogradov，2006），从而可能参与MAM诱导的神经元损伤，例如在雄性小鼠海马和PFC中发现的钙结合蛋白阳性神经元的选择性丢失（Chalkiadaki等，2019）。然而，这一假设应谨慎对待，因为NDUFB8的表达水平可能不能反映复合体I的活性，后者取决于NDUFB8与其他亚基的组装、其折叠、定位及插入呼吸链（Usmanova等，2024；Rosenberger等，2025）。MAM处理小鼠中复合体I和IV的大幅增加难以解释，因为产前暴露于MAM会导致皮层棘密度降低，这可能反映了神经元活动的减少（He等，2024）。

融合和分裂塑造了线粒体在应激下的可塑性，其平衡在调控炎症和免疫反应中发挥核心作用。融合将线粒体连接起来以改善呼吸功能并补偿潜在损伤。分裂将线粒体一分为二，要么对称分裂以增加线粒体数量，要么不对称分裂以通过线粒体自噬去除受损部分（Ye等，2025；Franchino等，2024）。线粒体融合由GTP酶MFN1和MFN2介导，二者可形成同源或异源二聚体；OPA1则完成线粒体内膜的融合（Ye等，2025）。MFN1具有较高的GTP酶活性，其作用是驱动膜锚定和融合；MFN1降低会导致融合减少和线粒体形态改变（Morcillo等，2021）。MFN2的GTP酶活性较低，除介导线粒体外膜融合外，还参与多种其他过程，如钙离子从内质网向线粒体的转移、NADH产生、PINK1介导的线粒体自噬以及线粒体沿轴突的转运。代谢应激条件下会导致MFN2降解，改变线粒体融合及所有其他MFN2介导的机制（Zaman和Shutt，2022；Zanfardino等，2025）。相反，MFN2表达增加与线粒体形态碎片化减少、超微结构完整性改善、炎症反应和氧化应激降低有关。然而，MFN2过度上调可能增强PINK1介导的线粒体自噬并恶化细胞生物能量学（Xiong等，2019；Harland等，2020；Zhao等，2021；Cheon等，2023；Lu等，2025）。MAM对MFN1和MFN2的影响具有性别依赖性且仅限于PFC。MAM降低了雄性小鼠的MFN1水平，大幅增强了雌性小鼠的MFN2水平，对OPA1水平无影响。这再次提示性激素影响MAM暴露后PFC的发育轨迹，在雄性中减少线粒体融合，而在雌性中增强MFN2的多效性作用。产前暴露于MAM的雌性小鼠PFC中MFN2水平近乎翻倍的升高，可被解释为一种旨在支持线粒体功能的代偿机制。

然而，过高的MFN2水平可能会增强PINK1介导的线粒体自噬，从而破坏线粒体生物合成与消除之间的平衡（详见下文）。动力蛋白相关蛋白1（Drp1）是线粒体分裂的主要调节因子，Drp1水平升高会导致线粒体形态改变、线粒体自噬增加、活性氧产生增加以及炎症小体和微胶质细胞激活。在慢性神经退行性疾病的前临床模型中，降低Drp1水平可改善认知功能并促进神经元存活。然而，在正常小鼠中降低Drp1水平会导致线粒体延长和细胞死亡（Cho等，2013年；Vantaggiato等，2019年；Cai等，2024年）。在海马CA1锥体神经元中条件性敲除Drp1的小鼠表现出突触传递障碍以及学习和记忆缺陷（Shields等，2015年）。产前暴露于MAM减少了雄性小鼠海马中的Drp1水平，这可能是新物体识别（NOR）测试中观察到的学习缺陷的原因之一。MAM处理的雌性小鼠前额叶皮层（PFC）和海马中Drp1水平升高，这可能与在小鼠精神分裂症MAM模型中观察到的PINK1诱导的线粒体自噬（类似于MFN2）和神经炎症有关（Zhong等，2024年）。

神经元和其他细胞中的线粒体密度由线粒体自噬与生物合成之间的平衡调节。线粒体自噬由PINK1及其靶蛋白parkin驱动，parkin使线粒体外膜和内膜蛋白泛素化。被标记的蛋白与自噬受体（如光素蛋白、NDP52、RABGEF1、Rab5和Rab7a）结合（Heo等，2015年；Palikaras等，2018年；Yamano等，2018年；Padman等，2019年；Borchers等，2023年；Wang等，2024年）。线粒体自噬减少会阻止受损或衰老线粒体的清除，导致活性氧产生、细胞死亡和炎症（Ge等，2020年；Fang等，2019年；Cen等，2021年；Li等，2022年）。因此，适度增加线粒体自噬可能在病理条件下支持神经元存活（Ge等，2020年；Fang等，2019年）。然而，线粒体自噬过度增加可能会耗尽线粒体池，引发能量危机，并导致不同类型的死亡表型，如凋亡和铁死亡（Doxaki和Palikaras，2021年；Zhu等，2024年；Tian等，2025年）。在线粒体自噬级联反应中，PINK1、Rab5和Rab7a并不总是共同调节，它们的水平、募集和活性可能以依赖于背景的方式受到不同程度的影响（Yamano等，2018年；Wu等，2021年）。此外，我们希望强调，PINK1不仅是线粒体自噬的主要驱动因子，也是线粒体生物合成、融合和分裂的关键调节因子（Ge等，2020年；Narendra和Youle，2024年）。接受MAM处理的雄性小鼠海马中PINK1减少，前额叶皮层中Rab5减少，提示线粒体自噬以脑区依赖的方式在不同水平上受到损害。雌性MAM暴露导致PINK1大幅增加，前额叶皮层和海马中光素蛋白和Rab5水平呈增加趋势，但前额叶皮层中Rab7a水平显著降低。可能的解释是，在接受MAM处理的雌性小鼠前额叶皮层中，受损线粒体上的蛋白被高效泛素化，但线粒体未能被充分隔离在自噬膜内——而Rab7a是这一过程所必需的（Yamano等，2018年）。

线粒体生物合成受核转录因子（如PGC-1α、NRF1、NRF2）的协同控制，这些因子进而促进线粒体转录因子（TFAM、TFB1M和TFB2M）的表达，介导线粒体DNA复制。活化的PGC-1α转位至细胞核，与NRF1、NRF2、雌激素受体-α（ERα）、雌激素相关受体-α（ERRα）和过氧化物酶体增殖物激活受体-α（PPARα）结合，调节基因表达（Ye等，2025年；Tanida，2022年；Cerutti等，2023年）。雌性小鼠前额叶皮层和海马中PGC-1α水平降低，前额叶皮层中NRF1水平升高。这很可能反映了雌性激素对线粒体生物合成蛋白标志物的作用。与此一致，研究发现慢性雌激素暴露可减少PGC-1α并增加NRF1蛋白水平及线粒体生物合成（Klinge，2008年；Mattingly等，2008年；Ivanova等，2013年；Gui等，2025年）。MAM暴露的影响则更难解释。在雄性中，MAM处理导致前额叶皮层中PGC-1α水平大幅下降、NRF1水平升高以及TFB2M水平无变化。NRF1水平的升高可能被视为一种代偿机制，旨在尽管PGC-1α减少仍能维持线粒体生物合成的稳态。在雌性中，MAM导致前额叶皮层中NRF1减少，令人意外的是TFB2M水平升高。一种可能的解释是MAM通过NRF1以外的机制增强TFB2M和线粒体生物合成。这一假说需要进一步研究。

总之，本研究证明产前暴露于MAM引起的精神病样表型与氧化磷酸化（OXPHOS）和线粒体质量控制（MQC）相关蛋白的性别二态性变化有关。精神分裂症中是否发生类似变化仍有待确定。已在精神分裂症患者白细胞和血小板中发现线粒体呼吸链复合体I不同亚基的增加，且与精神病症状严重程度相关（Haghighatfard等，2022年；Ben-Shachar等，1999年；Dror等，2002年；Jiang等，2019年）。然而，由于影响血液中线粒体蛋白表达的变量众多（如吸烟和/或药物治疗），这些发现难以解释。此外，有证据表明精神分裂症个体的神经皮质锥体神经元中线粒体基因表达下调（Glausier等，2020年；Lee等，2024年）。因此，我们的发现对精神分裂症病理生理学的意义尚不确定。这些结果应与精神分裂症个体及年龄匹配的双性对照组尸检脑组织的数据进行整合。

**数据声明**
所有免疫印迹结果均在手稿图7和图8中报告。所有个体数据均包含在图中（见图1、图2、图3、图4、图5、图6）。个体数据可根据要求提供。

**作者贡献声明（CRediT）**
Laura Norma：写作—审阅与编辑、写作—初稿、验证、方法论、调查、形式分析、数据管理。
Tiziana Imbriglio：写作—审阅与编辑、写作—初稿、验证、方法论、调查、形式分析、数据管理。
Rosamaria Orlando：调查。
Luisa Di Menna：调查。
Valeria Bruno：写作—审阅与编辑、可视化。
Giuseppe Battaglia：写作—审阅与编辑、可视化。
Milena Cannella：写作—审阅与编辑、监督、项目管理、概念化。
Ferdinando Nicoletti：写作—审阅与编辑、监督、项目管理、资助获取、概念化。

**伦理审批**
所有涉及动物的操作均遵守意大利（D.L. 26/2014）和欧盟指令（2010/63/EU）关于科学用途动物保护的规定。本研究获得Sapienza大学和IRCSS Neuromed当地动物福利机构（OPBA）以及意大利卫生部批准（授权编号：481/2025-PR和44/2025-PR）。

**生成式人工智能及AI辅助技术声明**
图形摘要通过人工智能与人工协作生成。

**资助**
本研究由IRCCS Neuromed以及PNRR—第四使命—第二组件—投资1.3、欧盟—下一代欧盟资助。

Laura Norma | Tiziana Imbriglio | Rosamaria Orlando | Luisa Di Menna | Valeria Bruno | Giuseppe Battaglia | Milena Cannella | Ferdinando Nicoletti