Lotus japonicus CLV1样受体HAR1在非共生条件下通过协调氮利用与初级代谢促进高硝酸盐依赖性生长

《Plant, Cell & Environment》：Lotus japonicus CLV1-Like Receptor HAR1 Promotes Nitrogen Utilisation and Growth Under Non-Symbiotic Conditions

　　

豆科植物与固氮细菌建立互惠共生，使其能够利用大气N₂。由于共生维持需要丰富的碳(C)源，豆科植物通过CLAVATA1 (CLV1)样受体系统性地控制根瘤数量，从而调节碳消耗与氮获取之间的平衡。在Lotus japonicus中，CLV1样受体HYPERNODULATION ABERRANT ROOT FORMATION1 (HAR1)在茎中发挥作用以调节根瘤形成，并参与共生C/N协调。这提示HAR1也可能在共生结瘤之外影响植物生长和氮利用。在本研究中，研究人员表明HAR1在调节氮利用以促进高硝酸盐可用性条件下的生长中起关键作用，即使在非共生环境中也是如此。与野生型不同，har1突变体未能响应较高硝酸盐可用性而增加其生长。这种生长响应的缺乏与单位叶面积净生物量生产速率降低以及单位植物氮的生物量生产能力降低相关。研究人员进一步发现，硝酸盐响应性TCA（三羧酸）循环相关有机酸在低硝酸盐条件下也高于野生型叶片。由于HAR1突变不影响光合性状，研究人员提出HAR1通过协调氮利用与初级代谢促进非共生条件下的生长。

研究背景：豆科植物可与固氮细菌建立互惠共生，利用大气N₂。共生需消耗大量光合产物，因此豆科植物通过CLAVATA1 (CLV1)样受体系统性地控制根瘤数，调节碳消耗与氮获取平衡。Lotus japonicus中CLV1样受体HYPERNODULATION ABERRANT ROOT FORMATION1 (HAR1)在茎中调控根瘤形成，并参与共生C/N协调。HAR1、SUPER NUMERIC NODULES (SUNN)和NODULE AUTOREGULATION RECEPTOR KINASE (NARK)等富亮氨酸重复受体样激酶(LRR-RLK)感知CLE信号肽，经miR2111、细胞分裂素和TOO MUCH LOVE (TML) F-box蛋白调控结瘤。LRR-RLK突变体因过度结瘤而生长受损。然而，HAR1等是否在非共生条件下也维持C/N平衡尚不清楚。har1、sunn和nark具有多效表型，如叶小、根短；大豆nark在非共生5 mM硝酸盐下叶氮含量较高，提示其可能影响氮分布。因此，研究人员聚焦har1生长抑制，探究HAR1在非共生条件下对生长、光合性状以及氨基酸和有机酸代谢的作用。

研究人员在不同硝酸盐水平、无根瘤菌条件下开展研究，发现HAR1对提高氮利用效率以促进生长十分重要。har1在高硝酸盐下生长抑制，氮生产力(NP)降低，而光合氮利用未受损；TCA循环相关有机酸积累增加。研究提出，HAR1通过协调氮利用与初级代谢促进非共生条件下的生长。其意义在于提示CLV1样受体在结瘤控制之外可能具有更广泛的硝酸盐依赖性生长与初级代谢协调功能。

关键技术方法：使用Lotus japonicus accession MG-20野生型、har1-7（LRR域W348stop无义突变null等位）及proHAR1:GUS株系；所有实验在灭菌、无根瘤菌条件下进行，以KNO₃为硝酸盐源。主要方法包括不同硝酸盐浓度下的生长分析，测定鲜重、干重、相对生长速率(RGR)、净同化速率(NAR)、叶质量面积(LMA)、叶面积比(LAR)、NP和氮吸收速率；用CN分析仪测氮；用便携式气体交换系统测CO₂响应曲线并计算最大RuBP羧化速率(V_cmax)和最大电子传递速率(J_max)；用液相色谱-质谱(LC-MS)测游离氨基酸和TCA循环有机酸，来自四个独立实验批次；用proHAR1:GUS组织化学染色分析表达模式；统计采用Tukey-HSD、Welch t检验和协方差分析(ANCOVA)。样本来源为MG-20背景，har1-7来源于MG-20，proHAR1:GUS在MG-20背景生成。

研究结果：
2.1 har1在高硝酸盐条件下表现出生长迟缓（har1 Showed Stunted Growth Under High Nitrate Conditions）。研究人员在无根瘤菌条件下，将1周龄苗移植到含1 mM或5 mM硝酸盐的蛭石中，3周后测茎和根重量。har1-7在5 mM硝酸盐下表现矮化，鲜重显著低于野生型，干重呈类似趋势；根冠比在两种基因型间无显著差异。结论是HAR1在硝酸盐依赖性生长促进中起重要作用。

2.2 har1突变体在充足硝酸盐条件下表现出氮生产力降低（har1 Mutant Exhibits Reduced Nitrogen Productivity Under Sufficient Nitrate Conditions）。研究人员先在1 mM硝酸盐下生长2周，再转移至1、2或5 mM硝酸盐11天，测干重和氮含量。野生型干重随硝酸盐增加而增加，而har1-7生长受硝酸盐水平影响很小，未能提高RGR；总氮含量无显著差异，但NP在所有条件下显著降低，且har1-7在2 mM时已降低。har1-7在2 mM硝酸盐下N_area显著较高，NAR在2和5 mM显著较低，LMA在5 mM较高；5 mM下茎氮较低、根氮较高，氮吸收速率在2和5 mM较低。结论是har1-7氮利用效率降低，HAR1涉及氮分配和吸收。

2.3 har1突变体能够根据叶片氮水平上调光合活性（The har1 Mutant Can Upregulate Photosynthetic Activity Corresponding to the Nitrogen Level in Leaves）。实验1中，2 mM硝酸盐生长的植株转至2或10 mM硝酸盐3天，野生型和har1-7光合速率无显著差异，V_cmax与N_area成比例。实验2中，1 mM硝酸盐生长的植株转至1或5 mM硝酸盐，野生型在高氮下光合速率和N_area增加，har1-7未增加；但V_cmax与N_area关系相似。四个独立实验的ANCOVA显示N_area与V_cmax、J_max显著正相关，基因型无显著影响。结论是har1-7在高硝酸盐下的矮化难以主要由光合性状解释。

2.4 har1突变体叶片中硝酸盐响应性TCA循环相关有机酸积累增加（har1 Mutant Exhibits Increased Accumulation of Nitrate-responsive TCA Cycle-related Organic Acids in Leaves）。proHAR1:GUS显示HAR1启动子在叶和根维管束有活性，主要在完全展开叶中，与大豆NARK相似。LC-MS分析四个独立实验发现，多数游离氨基酸无一致基因型差异；苹果酸、柠檬酸和琥珀酸在har1-7中可重复积累，在1和5 mM硝酸盐下均高于野生型，且在5 mM下更高。有机酸水平与植物生物量呈负相关；调整茎干重和实验批次后，柠檬酸和苹果酸在两种硝酸盐下仍显著较高，琥珀酸在1 mM下显著较高。结论是HAR1可能调节叶片TCA循环相关有机酸池，该变化不能仅由较小生物量解释。

讨论部分总结：氮与碳平衡对植物生长和发育至关重要。HAR1等CLV1样LRR-RLK在共生中通过限制根瘤数平衡氮获取与碳消耗。本研究表明，har1不能响应硝酸盐增加而促进生长，伴随NP降低，而光合氮利用未受损。代谢分析显示TCA循环相关有机酸，尤其苹果酸、柠檬酸和琥珀酸在har1叶中可重复积累，并响应硝酸盐可用性；游离氨基酸无一致基因型变化。由于TCA循环有机酸为氮同化和氨基酸合成提供碳骨架，其积累可能反映har1中硝酸盐相关初级代谢改变。NP在野生型1至2 mM硝酸盐间相对稳定、5 mM下降，而har1在2 mM已降低，提示其单位植物氮的生物量生产在较低硝酸盐下受限。HAR1可能促进氮向生物量生产的利用、分配和吸收，而非维持光合能力。LMA较高、LAR较低和NAR较低提示har1单位生物量叶面积较小，可能与氮利用、初级代谢和叶扩张协调改变有关。AON相关组分在非共生氮响应中可能具有更广泛功能，但HAR1是否通过同一AON途径控制硝酸盐依赖性茎生长尚不清楚。研究结论翻译：由于HAR1突变不影响光合性状，研究人员提出，HAR1通过协调氮利用与初级代谢促进非共生条件下的生长；这些结果提示，HAR1可能通过将氮利用与初级碳代谢联系起来，促进非共生条件下有效的硝酸盐依赖性生长，而改变的TCA循环相关有机酸池为这一作用提供了代谢线索。