拉斯维加斯总空气真菌计数的显微镜法与定量实时PCR（QPCR）比较：浓度差异、季节模式及环境监测意义

《Journal of Microbiological Methods》：Comparison of microscopy and quantitative real-time PCR for the enumeration of total airborne fungi in Las Vegas, Nevada

　　

对空气真菌的定量评估对于环境监测和公共卫生至关重要。然而，方法学差异会显著影响所报告的浓度。本研究比较了显微镜计数与定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction, QPCR）在测量拉斯维加斯总空气真菌浓度中的效果，该地区区域数据仍然有限。2022年1月至12月，使用容积式孢子采样器（volumetric spore samplers）从五个永久站点采集空气样本用于显微镜分析，并使用便携式过滤采样器（portable filtration samplers）从13个邻近站点采集样本用于QPCR分析。显微镜分析按照美国国家过敏局（National Allergy Bureau, NAB）方案在1000×放大倍数下进行，而QPCR使用经过验证的通用真菌PCR检测靶向真菌rDNA（ribosomal DNA）基因中高度保守区域。总体而言，QPCR测得的总真菌平均浓度约为显微镜测得的七倍。季节比较显示两方法结果不同：QPCR在春季和夏季浓度较高、冬季较低；显微镜则在冬季较高、夏季较低。两方法间浓度差异具有统计学显著性。QPCR检测到更高浓度可能反映了使用多拷贝基因（multicopy gene）作为靶序列，而显微镜可能由于非生物颗粒（non-biological particulates）干扰而低估总真菌负荷。这些发现突出了空气真菌监测中的重要方法学考虑，并支持整合分子技术以增强环境健康监测。

空气真菌（airborne fungi）孢子的定量评估是公共卫生和环境健康研究与监测的重要组成部分。其定量数据可反映真菌生态、过敏原暴露和疾病流行病学特征。显微镜计数（microscopic enumeration）和定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction, QPCR）是估计总真菌孢子浓度的常用方法，但二者输出不同：显微镜给出物理计数，QPCR给出DNA数量；其局限也不同。显微镜可直接观察并计数真菌孢子，具有简便、成本相对较低、可识别孢子与菌丝等形态特征的优势，尤其可捕获不可培养孢子；但其劳动密集，受操作者变异影响，不能区分活孢子与非活孢子，并可能受颗粒物干扰。QPCR灵敏度高、特异性强，可在复杂环境样本中检测和定量低水平真菌类群，但其定量的是总靶DNA，不论细胞活力，且可能受DNA提取效率和环境基质抑制影响。美国尤其是内华达州拉斯维加斯的空气真菌文献非常有限。已有研究报道拉斯维加斯不同站点平均真菌孢子浓度介于318至488 spores/m³，最高浓度出现在春季；近期QPCR研究显示总空气真菌浓度较既往拉斯维加斯显微镜计数高4.66至7.16倍。因此，研究人员在邻近采样点同时采集空气样本，比较显微镜计数与QPCR测定拉斯维加斯总空气真菌浓度的结果。该研究旨在推进对空气真菌定量方法学差异的理解，并帮助公共卫生和环境评估中选择合适监测方法。

开展研究用到的主要关键技术方法不超过250字：2022年1月1日至12月31日，于拉斯维加斯谷采集样本。显微镜分析样本来自5个花粉监测点，包括4个克拉克县学区（Clark County School District, CCSD）校址和1个美国国家过敏局（National Allergy Bureau, NAB）认证站点内华达大学拉斯维加斯分校（University of Nevada, Las Vegas, UNLV）；使用Burkard容积式孢子采样器（volumetric spore sampler），按美国过敏、哮喘与免疫学学会（American Academy of Allergy, Asthma & Immunology, AAAAI）/NAB方案，在1000×油镜下计数，以spores/m³表示。QPCR样本来自13个邻近站点，使用便携式过滤空气采样器（portable filtration air sampler），100 L/min，24 h，共144 m³，采集于3.0 μm聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene, PTFE）膜。通用真菌PCR靶向249 bp高度保守多拷贝rDNA区域（5.8S—ITS2—28S rRNA），设内部阳性对照（internal positive control, IPC）和无模板对照（no template control, NTC），以A. fumigatus标准曲线定量，环阈值（cycle threshold, Ct）转换为copies/m³。采用威尔科克森符号秩检验（Wilcoxon Signed Rank test）按日期配对比较。

3.1 使用显微镜计数定量环境空气样本（Quantification of environmental air samples using microscopic enumeration）：显微镜计数所得真菌孢子平均浓度为325 spores/m³ ± 254（1标准误，SE）。3个显微镜分析样本因设备故障出现异常值而被剔除。显微镜计数（n = 101）范围为23至1921 spores/m³。四季平均真菌浓度为244至488 spores/m³，最高浓度出现在冬季。该部分通过5个站点每日样本的显微镜计数得出上述结论。

3.2 用于通用真菌PCR分析定量的真菌PCR标准品（Fungal PCR standards for quantification using universal fungal PCR analysis）：以已知浓度的A. fumigatus DNA与Ct值构建标准曲线。扩增效率为94.23%。最佳拟合线方程为y = ?3.4683x + 33.132，相关系数r²为0.9984。该方程用于估计环境样本每m³空气中总真菌DNA浓度。

3.3 使用通用真菌PCR分析定量环境空气样本（Quantification of environmental air samples using universal fungal PCR analysis）：所有环境样本均产生扩增，未观察到PCR抑制。2022年环境样本（n = 103）平均Ct值为21.81（标准差，SD = 0.75），平均真菌浓度为2291（SD = 1224）。冬季样本（n = 25）平均Ct值为22.36（SD = 0.51），平均真菌浓度为1500（SD = 520）。春季（n = 27）平均Ct值为21.67（SD = 0.63），平均真菌浓度为2432（SD = 935）。夏季样本（n = 25）平均Ct值为21.31（SD = 0.69），平均真菌浓度最高，为3027（SD = 1495）。秋季（n = 26）平均Ct值为21.92（SD = 0.78），相应平均真菌浓度为2170（SD = 1185）。阳性对照平均Ct值为15.12（n = 12）。DNA提取对照中除1个外均产生阳性结果，Ct值介于23.48至34.50，平均值为27.94。通用真菌PCR的NTC Ct值在所有PCR中均未确定。IPC的NTC平均Ct值为27.48（n = 12）。该部分通过通用真菌PCR和标准曲线定量环境空气样本得出上述结论。

3.4 显微镜计数与QPCR的比较（Comparison between microscopic enumeration and QPCR）：总体而言，QPCR测得的总真菌孢子浓度高于显微镜。QPCR总体平均值约为显微镜平均总真菌孢子浓度的7倍。两方法季节趋势不同：显微镜显示冬季和春季季节性真菌浓度较高；QPCR显示春季和夏季较高。此外，冬季和春季QPCR平均总真菌浓度分别约为显微镜的3倍和7倍；夏季和秋季QPCR平均总真菌分别约为显微镜的14倍和9倍。威尔科克森符号秩检验总体结果显示，显微镜与QPCR平均总真菌浓度差异显著（z = ?8.84；p < 0.01）。各季节两种方法所得浓度差异也均具有统计学显著性（z = ?4.32至?4.54；p < 0.01）。该部分通过按样本采集日期配对比较两方法结果得出上述结论。

讨论部分，研究人员指出，本研究比较了拉斯维加斯空气真菌总浓度在显微镜计数与QPCR之间的差异，结果显示QPCR测得的真菌浓度持续且显著高于显微镜，平均约高7倍。这凸显了显微镜与分子定量技术之间的根本方法学差异，并显示QPCR方法在环境和公共卫生监测中的优势。QPCR观测到更高浓度与既往研究一致，即分子方法因灵敏度更高并检测总DNA，可比显微镜或培养法检测到更大总真菌负荷。QPCR靶向可存在于活细胞和非活细胞中的DNA序列，因此可更全面估计环境样本中真菌总存在量；显微镜依赖孢子或菌丝的视觉识别，可能因样本损失、操作者变异或非生物颗粒干扰而低估总浓度。本研究所用通用真菌PCR检测靶向多拷贝基因（5.8S至28S rRNA）。内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）区域依真菌物种不同，每个基因组约存在100至300个拷贝。基于多拷贝基因的PCR检测更灵敏、更特异，但也可能高估空气真菌实际浓度；若纳入多个不同多拷贝基因数的物种，可能提供更好的定量估计。季节模式因分析方法而异：QPCR测得真菌浓度在夏季和春季最高，冬季较低，这与春季孢子浓度升高的既往发现一致；显微镜测得最高真菌浓度为冬季，其次为春季、秋季和夏季。显微镜分析的变异性相对QPCR较高。QPCR夏季浓度升高可能反映较高温度、低湿度和风事件导致真菌材料再悬浮。两方法间季节差异还可能源于采样效率差异或结果变异。尽管绝对浓度和季节排序存在差异，显微镜与QPCR总体对应支持两种方法的生态有效性。QPCR显示的季节变化提示环境因素驱动，而非仅由方法学造成。

讨论还指出QPCR方法的局限：QPCR真菌浓度使用A. fumigatus标准品确定，因此代表A. fumigatus等价基因组估计，而非独立于分类群的总真菌浓度测量。由于rDNA拷贝数在真菌分类群间差异显著，Ct值向真菌浓度的转换依赖 underlying fungal composition，可能高估或低估真实真菌浓度。此外，该检测定量总DNA，不能区分活孢子与非活孢子。本研究未测定DNA提取效率，提取损失可能影响所报告DNA浓度；但加标对照产生一致扩增，在115个共提取加标样本中出现1个假阴性结果。另一局限是使用3.0 μm PTFE膜，小于3.0 μm的孢子可能穿过滤膜，可能导致真菌浓度低估；不过大多数物种直径为3至30 μm。此外，两方法采样位置不同（相距1至9 km），且采样器未共位，这也是局限，可能造成测得浓度变异。未来研究应共位放置两种方法的采样器以减少空间变异，将多个物种纳入校准标准以更好估计真菌浓度，并纳入额外质量控制措施，如孢子活力检测。显微镜局限方面，使用两种采样头反映操作要求而非有意方法学比较；尽管两种采样配置均为气传生物学监测常用标准方法，但收集基质、黏合剂暴露时间和制片程序差异可能影响颗粒保留和回收。显微镜的其他局限包括油镜分析劳动密集，以及使用单一纵向扫描，仅计数收集表面的一部分；该方法可能增加采样不确定性，尤其在空气真菌浓度相对较低时，并可能较更广泛计数方法低估或高估总孢子浓度。所有显微镜样本均由同一认证分析员分析，以确保研究一致性，因此无需进行观察者间或观察者内可靠性评估。缺乏独立可重复性评估也是本研究局限。两方法间观察到的真菌浓度差异可能反映方法学差异和空间变异的共同作用，而不仅是分析方法所致。Burkard容积式采样器与HI-Q PSU过滤采样器在采集机制（撞击与过滤）、采集效率和采样空气体积方面存在差异，可能影响样本采集和定量。Burkard采样器因采样空气体积相对较低，可能导致每样本计数孢子较少，从而增加显微镜相对计数不确定性；HI-Q采样器处理更大空气体积，可能降低采样变异，并增加可用于DNA分析的真菌材料量。约7倍差异可能反映采样方法、采集效率、分子定量及rDNA拷贝数等生物因素的综合影响，而非单一因素。尽管存在这些局限，本研究将通用真菌QPCR检测应用于拉斯维加斯谷环境空气监测，该检测稳健，未观察到PCR抑制且扩增效率高。结果表明，在沙漠城市环境中进行真菌分子检测具有可行性和可靠性。将QPCR整合到空气质量监测项目可增强真菌过敏原检测，并为哮喘或其他呼吸敏感个体提供潜在暴露信息。

研究结论翻译：总之，显微镜计数和QPCR均为空气真菌暴露提供了有价值的信息。显微镜提供形态学确认和分类学背景，而QPCR提供更高的灵敏度和精密度。这些方法之间观察到的差异强调了需要标准化方案和交叉验证，以确保环境真菌负荷的准确定量。继续使用QPCR等分子方法将增进对真菌生态学和环境健康评估的理解，并加强内华达州拉斯维加斯及其他沙漠环境中的公共卫生监测。