《Nature Neuroscience》：CLOK: a chemigenetic multicolor labeling system to visualize neuronal birthdate and circuit integration
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理解神经元如何整合进入发育中的回路并贡献功能性活动，对于解码脑发育和可塑性至关重要。然而，当前研究神经元整合的方法常受低通量、有限时空分辨率或侵入性操作限制。为克服这些挑战，研究人员提出CLOK（Chromatic halotag Labeling for c
理解神经元如何整合进入发育中的回路并贡献功能性活动，对于解码脑发育和可塑性至关重要。然而，当前研究神经元整合的方法常受低通量、有限时空分辨率或侵入性操作限制。为克服这些挑战，研究人员提出CLOK（Chromatic halotag Labeling for cell Ontogeny tracKing），一种基于HaloTag技术及其广泛荧光配体（fluorescent ligands）库的in vivo出生日期标记策略。研究人员证明，CLOK可按出生日期对神经元及其亚细胞结构进行精确颜色编码，并允许追踪发育中斑马鱼（zebrafish）视觉和运动系统中新生神经元的功能成熟，揭示早生和晚生神经元的不同成熟轨迹。研究人员进一步将该方法与光学工具耦合，实现年龄特异性多色钙成像（calcium imaging）和电压成像（voltage imaging）以及光遗传学操作（optogenetic manipulation），从而证明其多功能性。总之，CLOK为在生长且行为中的脊椎动物中对神经元回路成熟进行光学解析提供了强大而灵活的工具。
该研究发表于《Nature Neuroscience》，围绕神经元如何整合入发育中的神经回路并参与功能活动这一核心问题展开。现有研究神经元整合的方法存在明显局限：BrdU（bromo-deoxyuridine）和EdU（5-ethynyl-2′-deoxyuridine）等胸苷类似物需组织固定，不能用于活体功能研究；DNA电转或热激稀疏标记通量低、操作繁琐且常具侵入性；CRISPR（成簇规律间隔短回文重复）策略需大量优化且报告基因切换效率低；光转换荧光蛋白不能分辨特定时间段内出生的神经元；荧光方法还常与光遗传学（optogenetics）或活动成像工具光谱重叠。为此，研究人员开发了CLOK（Chromatic halotag Labeling for cell Ontogeny tracKing），一种基于HaloTag（一种自标记蛋白标签）和Janelia Fluor（JF）染料（荧光配体）的化学遗传学出生日期标记策略，并在斑马鱼（zebrafish）中验证其分辨率、稳定性和功能兼容性。该研究得出结论：CLOK可在活体内按出生日期精确标记神经元及其亚细胞结构，支持长期追踪、多年龄组同时标记、钙/电压成像和光遗传学操控，为研究神经发育、回路整合和可塑性提供了优于现有方法的平台。
关键技术方法简要概括：研究人员主要以斑马鱼胚胎和幼鱼为样本队列，使用表达HaloTag的转基因系，通过顺序孵育JF染料进行出生日期标记，并与EdU标记比较；采用共聚焦、白激光共聚焦、双光子（two-photon，2P）和光片显微镜成像；结合GCaMP6s、jGCaMP7s、WHaloCaMP等钙指示剂，Voltron2电压指示剂以及CoChR-HaloTag视蛋白进行功能成像和全息光遗传刺激；记录肌电（electromyogram，EMG）活动；将图像配准至ZBB（Zebrafish Brain Browser）和MapZebrain图谱，并使用GMM（Gaussian Mixture Model）和Rastermap等分析。部分光电流验证使用CHO（Chinese hamster ovary）细胞。
研究结果如下：
1. CLOK提供基于神经元年龄的全脑拓扑组织清晰视图。研究人员在表达HaloTag和膜定位GFP的斑马鱼中显示，JF525与GFP共定位达97.43±1.8%；未结合染料在4 h内几乎完全洗脱；早期加载单种或多种JF染料未见明显发育影响。与EdU比较，CLOK能标记出生日期定义的神经元群，具有更高出生日期分辨率，在elavl3启动子下时间分辨率约为6 h或更短。
2. CLOK揭示亚细胞水平全脑时间顺序组织并实现多个神经元年龄组同时标记。通过将HaloTag与突触素标签或Voltron1-Kv2.1定位序列融合，研究人员分别观察轴突终末和胞体树突，发现晚生神经元的轴突终末逐渐占据神经毡外层，而多数树突区域由最早出生组主导。使用五种JF染料每24 h加载，可在单条鱼中同时可视化五个年龄组。
3. CLOK在幼鱼阶段实现持久、稳定、明亮标记。HaloTag标记在受精后8周仍可检测；5 d.p.f.标记的神经元在14或21 d.p.f.仍清晰；1、3和5 d.p.f.三次标记仍能区分出生日期；该方法兼容固定和冷冻切片，并在幼鱼中显示类似幼虫期的拓扑组织。
4. CLOK允许追踪早期和晚期出生顶盖（optic tectum，OT）神经元视觉反应成熟。结合GCaMP6s和视觉刺激，宏观区域及单细胞分析显示，早生脑室周围神经元（periventricular neurons，PVNs）对移动光栅和looming刺激反应更强，方向选择性（DS）更强；晚生神经元随发育逐渐成熟；神经毡中间神经元即使空间混合，也可按出生日期分离并分析。
5. CLOK实现后脑神经元年龄组功能成熟纵向追踪。研究人员标记<24 h.p.f.和24–48 h.p.f.神经元，在2和4 d.p.f.结合EMG和jGCaMP7s成像，发现2 d.p.f.时早生组多数活跃而晚生组少数活跃；4 d.p.f.时晚生组活跃比例和功能多样性增加，早生组也参与新出现行为，提示年龄组间协调可能参与运动行为发育。
6. 将CLOK与传感器和致动器整合用于出生日期选择性功能成像和光激活。WHaloCaMP钙成像显示早生神经元自发事件频率更高；Voltron2电压成像可检测动作电位并提取放电率；CoChR-HaloTag结合全息光刺激可选择性激活早生或晚生神经元，二者ΔF/F变化相似，且JF成像诱导的伪光电流较小。
讨论部分总结：现有出生日期标记方法各有缺陷，而CLOK可在活体内以单细胞分辨率标记整个神经元群体，避免细胞间标记随机性；其HaloTag工程简单，可融合亚细胞定位标签，兼容钙/电压成像和光遗传学操控，并支持最多五个年龄组同时标记。JF染料与GFP基指示剂在单光子和2P激发下可分离，HaloTag本身无荧光，故CLOK转基因系光谱中性。局限包括：启动子类型影响时间边界，染料内酯–两性离子平衡影响生物利用度和年龄组边界，蛋白标签影响蛋白周转，染料比例作为连续变量需验证；核心机制可扩展至秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）、果蝇（Drosophila）、小鼠（mouse）或类器官系统。
研究结论翻译：总之，CLOK提供了一种实用、非侵入性的方式，将精确的出生日期标记与不断增长的HaloTag试剂工具箱相结合。通过在单一框架内整合单细胞分辨率出生日期标记、功能成像和全光学回路操控，它为从解剖、生理和回路水平研究神经元整合提供了平台，在可靠性和灵活性方面优于现有方法。
