尾草履虫中的转录重编程与表观遗传调控：一个研究极端生殖系 DNA 消除的新模型

《Journal of Genetics and Genomics》：Transcriptional reprogramming and epigenetic regulation in Paramecium caudatum: a new model for studying extreme germline DNA elimination

摘要
后生动物通过小RNA介导的沉默机制抑制转座子，而纤毛虫则进化出一种独特的抑制策略，即在体细胞大核基因组发育过程中通过物理消除转座子，为转座子调控和程序性DNA重排提供了独特的模型。草履虫中的尾草履虫表现出真核生物中已知最极端的DNA消除现象，移除了超过98%的生殖系基因组，但其分子基础和潜在机制仍然未知。在此，我们展示了一个高质量的、接近染色体水平的体细胞大核基因组组装，该组装具有异常紧凑的结构，超短的无翻译区和高的基因密度。对15个生命周期阶段的全面转录组分析揭示了有性生殖期间广泛的转录重编程。共鉴定出8260个发育调控基因，形成10个共调控簇。虽然核心DNA消除机制似乎保守，但与相关物种相比，许多调控基因表现出不同的表达模式。我们进一步证明组蛋白甲基转移酶Ezl1和Ezl3以核特异性的方式沉积抑制性标记H3K9me3/H3K27me3，显示出与其他纤毛虫中先前报道不同的功能特化。我们的发现确立了尾草履虫作为研究极端基因组重排的独特模型，并提供了关于控制真核生物转座子沉默和基因组稳定性的表观遗传机制进化的新见解。

引言
大多数生物体依赖Piwi相互作用RNA（piRNAs）通过转录和转录后沉默机制严格控制转座元件（TEs）（Aravin et al., 2007; Friedli and Trono, 2015; Chuong et al., 2017; Ozata et al., 2019）。相比之下，纤毛虫——一个在一亿年前出现的高度分化单细胞生物类群——采用了一种更为极端的策略来沉默TEs，即通过复杂的小RNA介导的基因组重排直接将TEs从活跃的体细胞大核基因组中消除（Mochizuki et al., 2002; Gao et al., 2023; Gao et al., 2025; Zhang et al., 2025）。这主要归因于纤毛虫的独特生物学特性。纤毛虫表现出核二态性，在同一个细胞中维持二倍体生殖系小核（MIC）和多倍体体细胞大核（MAC）（Prescott, 1994; Hao et al., 2024; Zuo et al., 2026）。在有性生殖（一个被称为接合的特化过程）期间，母体小核进行减数分裂产生单倍体配子核，这些核在交配对象之间相互交换，在每个细胞中产生合子核。该合子核随后分裂和分化，产生新的小核和大核（Calkins and Cull, 1907; Raikov, 1972; Orias, 1986; Zhang et al., 2023）。在新的大核发育过程中，TEs、内部消除序列（IESs）和其他重复序列通过程序性基因组重排被移除，从而形成一个简化的、功能性的体细胞基因组（Arnaiz et al., 2012; Gao et al., 2023; Lyu et al., 2024; Cai et al., 2025）。纤毛虫的基因组重排过程为阐明转座子调控和基因组进化的基本机制提供了非凡的机会。

对纤毛虫基因组重排的研究揭示了多样的小RNA介导途径。例如，在四膜虫的小RNA介导途径中，从小核基因组转录的双链长链非编码RNA（lncRNAs）被Dicer样蛋白切割成名为scnRNAs的小RNA（Lepère et al., 2008; Sandoval et al., 2014）。这些scnRNAs被Piwi蛋白运输到母体大核，在此处scnRNA-Piwi复合物通过与新生转录本碱基配对进行"扫描"过程（Bouhouche et al., 2011）。扫描后，与体细胞大核匹配的scnRNAs在配子体特异性因子1（GTSF1）的帮助下被降解，而剩余的生殖系特异性scnRNAs被运输到正在发育的新大核中（Wang et al., 2024; Charmant et al., 2025）。这些scnRNAs通过招募多梳抑制复合物2（PRC2）引导对TE和IES区域的识别，其核心组分Ezl1组蛋白甲基转移酶催化组蛋白H3在第9位和第27位赖氨酸的三甲基化（H3K9me3和H3K27me3）（Lhuillier-Akakpo et al., 2014; Frapporti et al., 2019; Miró-Pina et al., 2022; Wang et al., 2022）。这些组蛋白标记随后招募转座酶PiggyMac（Pgm）以消除TEs和IESs（Baudry et al., 2009; Bischerour et al., 2018; Balan et al., 2026）。该机制用于在新的大核基因组发育期间消除四膜虫30%的生殖系DNA。相比之下，远缘相关的纤毛虫斜口虫和双点虫通过一种明显不同的机制消除约80%的生殖系DNA，其中来自母体大核的小RNA被运输到发育中的新大核，以保护预定保留的大核DNA序列（Nowacki et al., 2008; Fang et al., 2012; Chen et al., 2014; Yerlici and Landweber, 2014; Chen et al., 2019; Lyu et al., 2025）。

纤毛虫表现出显著的物种多样性，不同物种在基因组结构、基因组重排过程、TE组成和DNA消除机制方面存在显著差异。每个纤毛虫物种所采用的特定基因组重排机制必须在每次接合事件后可靠地重现其独特的大核基因组特征。迄今为止，这些机制的细节仅在少数几个物种中得到了深入研究。扩大基因组重排研究以包含更多样化的物种样本对于加深我们对转座子调控和基因组重排的进化与分子机制的理解至关重要。最近的研究表明，尾草履虫在超过1.82亿年前与四膜虫发生分歧（Wang et al., 2026），拥有纤毛虫中报告的最大小核基因组（不同菌株为1.6 Gb至5.5 Gb，主要由于丰富的卫星重复序列），远超四膜虫108 Mb的小核基因组（Sellis et al., 2021）。相比之下，其体细胞单倍体大核基因组小于40 Mb，约为四膜虫的一半（McGrath et al., 2014; Arnaiz et al., 2017; Liu et al., 2026），表明在大核发育期间超过98%的生殖系基因组被消除。此外，尾草履虫在接合期间的核发育过程和基因操作方法已在先前的研究中得到充分表征（Yang et al., 2007; Gao et al., 2024）。这凸显了尾草履虫作为大规模DNA消除以及转座子调控和基因组重排多样化途径研究的理想模型。

然而，尾草履虫中这种大规模DNA消除过程的分子基础仍然完全未知。目前可获得的最近期的尾草履虫大核基因组组装发表于十年前以上（ParameciumDB中的43c3d菌株，GenBank: GCA_000715435.1），依赖于Illumina短读长测序方法（McGrath et al., 2014）。该初步组装高度碎片化，由超过1202个支架组成（其中426个小于200 bp），没有完整的染色体，且有1414个支架内缺口。此外，尾草履虫在有性生殖期间的基因表达数据尚未可获得。这些限制严重限制了该物种中基因组结构和基因组重排的系统研究。为了解决这些限制，我们首先利用PacBio长读长测序和Illumina短读长测序为尾草履虫（6号菌株）生成了一个高质量的大核基因组组装，并利用来自营养生殖和有性生殖阶段的全长转录组数据注释其基因结构。然后我们进行转录组数据的聚类分析，识别跨15个生命周期阶段差异表达的基因，并将此数据集与四膜虫的数据集进行比较，以识别参与基因组重排的候选基因并揭示基因表达调控的分歧。最后，我们从该列表中选择了基因进行实验分析，以探索它们在基因组重排中的功能，重点关注该过程的表观遗传调控。我们的发现凸显了尾草履虫作为研究极端DNA消除以及真核生物中控制转座子沉默和基因组稳定性分子机制进化的模型。

章节片段
尾草履虫6号菌株的大核基因组
为获得更完整的尾草履虫大核基因组组装，我们采用了Illumina短读长测序和PacBio HiFi长读长测序对新收集的6号菌株进行测序（在以下文本中，除非另有说明，"Paramecium caudatum"特指6号菌株），生成了25.2 Gb短读长和21.0 Gb HiFi读长，每个数据集对应平均深度超过约700×（表S1）。利用这些数据，我们生成了接近染色体水平的大核基因组组装。

尾草履虫大核基因组的独特特征
高质量的大核基因组组装和准确的基因注释对于研究基因功能、调控网络和分子机制是必不可少的。在这项研究中，我们获得了尾草履虫6号菌株的近完整大核基因组组装，并通过整合多组学证据注释其基因结构。6号菌株的基因组组装在染色体完整性和结构注释完整性方面都显示出显著优势。结果表明，尾草履虫株的大核基因组具有异常紧凑的结构特征、超短的无翻译区（UTRs）和高基因密度。

尾草履虫菌株的培养和接合
两个互补交配型的尾草履虫菌株（5和6）由中国浙江农林大学教授杨先宇教授慷慨提供。细胞培养按照之前描述的方法进行（Gao et al., 2024）。细胞在25°C的培养基中培养（5%新鲜生菜汁稀释在KDS溶液中），接种肺炎克雷伯菌。通过饥饿和混合高反应性互补交配型细胞诱导接合。为了获得更...

代码可用性
本研究中使用的所有脚本均可在Zenodo（https://zenodo.org/records/18609866）和Github（https://github.com/WangRuiMoonKeeper/PcaudatumStrain6MACgenomeTranscriptomes）上获取。

未引用的参考文献
Ye et al., 2025.

数据可用性
本论文中报告的基因组序列数据已存入中国科学院北京基因组研究所/国家生物信息中心的国家基因组数据中心基因库，登录号为GWHJWDE00000000.1，可在https://ngdc.cncb.ac.cn/gwh公开获取。本论文中报告的原始序列数据已存入国家基因组数据中心的基因组序列档案...

CRediT作者贡献声明
Yunyi Gao：概念化、方法学、验证、调查、可视化、撰写-原稿、撰写-审阅与编辑。Rui Wang：概念化、方法学、可视化、撰写-原稿、撰写-审阅与编辑。Yueer Yu：方法学、验证、调查、撰写-审阅与编辑。Naomi A. Stover：资金获取、撰写-审阅与编辑。Feng Gao：监督、项目管理、概念化、撰写-审阅与编辑、资金

利益冲突
作者声明他们没有竞争利益。

致谢
本研究得到中国国家自然科学基金（项目号32470512、32270539）、山东省青年泰山学者计划（tsqn202408084）、山东省自然科学基金（ZR2026QC0324）和美国国立卫生研究院（P40OD010964）的支持。我们要感谢宋伟波教授（中国海洋大学）在稿件准备过程中提供的建议。我们感谢高性能生物超级计算中心的...

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