内生真菌 Diaporthe raonikayaporum 对刚果红（Congo Red，CR）的生态友好型生物脱色与解毒：UV–Vis、HPLC 与 GC–MS 整合证据及植物毒性评价

《Journal of Hazardous Materials Advances》：Eco-friendly Biodecolorization and Detoxification of Congo Red by the Endophytic Fungus Diaporthe raonikayaporum

　　

摘要
• 内生真菌 Diaporthe raonikayaporum 在优化条件下有效脱色刚果红（Congo Red，CR）。
• 紫外–可见光谱（UV–Vis）分析显示，在优化条件下刚果红脱色率为98.8%。
• 热灭活生物量（heat-inactivated biomass）和无细胞上清液（cell-free supernatant）表明多种机制对染料去除有贡献。
• 木质素分解酶（ligninolytic enzyme）活性对刚果红脱色有贡献。
• 色谱分析揭示了真菌处理后的推定转化产物（putative transformation products）。

研究背景与科学问题

淡水对维持人类健康、农业生产、工业发展和生态系统功能均不可或缺。工业化、城市化和人口增长导致多种污染物持续进入水生环境，包括重金属、农药、药物、石油烃、塑料和合成染料。纺织部门是染料污染废水的重要来源，其废水中常含刚果红（Congo Red，CR）等持久性偶氮染料。CR 是联苯胺基偶氮染料（benzidine-based azo dye），具有稳定的偶氮键（–N=N–）和复杂芳香结构，因而抗常规处理，并可能在降解过程中产生毒性芳香胺。染料废水还会降低水体光穿透，干扰光合作用，提高生化需氧量（biological oxygen demand，BOD）和化学需氧量（chemical oxygen demand，COD）。现有吸附、混凝–絮凝、膜过滤、高级氧化和电化学处理等可去除染料，但吸附主要是将污染物从液相转移至固相，常需再生、处理或处置废弃吸附剂；其他方法可能存在高运行成本、高能耗或二次废物问题。真菌介导的染料转化因可转化污染物而非仅转移污染物而受到关注。白腐真菌研究较多，但内生真菌，尤其是 Diaporthe 属，对偶氮染料脱色与转化的研究仍有限。既往研究多聚焦脱色效率，较少整合酶活性、生物量相关和胞外贡献、色谱变化、转化产物及植物毒性，且常未评估处理后产物毒性是否降低。因此，研究人员针对从 Sterculia urens 获得的内生 Diaporthe raonikayaporum，开展 CR 脱色、转化和解毒潜力评估。

研究人员开展的研究与总体结论

研究人员从 Sterculia urens 叶、茎和树皮分离内生真菌，经形态学和多基因系统发育将目标菌株鉴定为 D. raonikayaporum；随后优化 CR 脱色条件，评价木质素分解酶（ligninolytic enzyme）活性，开展热灭活生物量、无细胞上清液（cell-free supernatant，CFS）和酶抑制实验，并结合动力学、UV–Vis、HPLC、GC–MS、SEM/TEM、ECOSAR 及植物毒性试验进行综合分析。总体结论为：优化条件下 UV–Vis 脱色率达98.8%；生物量相关相互作用与胞外代谢/酶过程共同参与；漆酶（laccase）和锰过氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）与脱色相关，抑制实验提示二者均参与且漆酶抑制影响较大；色谱分析显示母体染料减少并生成推定转化产物；处理后染料溶液的预测生态毒性和植物毒性降低。该研究支持 D. raonikayaporum 作为生态友好型 CR 生物修复候选，并为后续机制研究和真实废水应用提供基础。

主要关键技术方法

研究人员从 Sterculia urens 叶、茎和树皮分离内生真菌，以叶印迹法验证表面灭菌效果，采用形态学及内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）、钙调蛋白（calmodulin，CAL）和 β-微管蛋白（β-tubulin，TUB2）多基因系统发育鉴定菌株；以愈创木酚平板筛选漆酶。液体培养中监测 CR 脱色，采用单因素（one-factor-at-a-time，OFAT）优化 pH、温度、初始染料浓度和生物量剂量；设置热灭活生物量、无细胞上清液和 NaN₃ 抑制漆酶/MnP 实验；测定漆酶和 MnP 活性；以紫外–可见光谱（UV–Vis）、高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）和气相色谱–质谱（gas chromatography–mass spectrometry，GC–MS）分析脱色和转化产物；以扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）和透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）观察超微结构；以生态结构活性关系（Ecological Structure Activity Relationship，ECOSAR）预测水生毒性，并用 Pennisetum glaucum 种子发芽评估植物毒性。样本来源为 S. urens 内生真菌分离株，非队列研究。

研究结果

3.1 从 Sterculia urens 分离内生真菌
从叶、茎和树皮共获得6株形态不同的内生真菌。基于形态观察和多基因系统发育分析，最具 CR 脱色潜力的菌株被鉴定为 D. raonikayaporum；显微观察显示分隔菌丝和与 Diaporthe 属一致的孢子形态。

3.2 平板法筛选漆酶
所有分离株均显示胞外酶活性，6株中4株在愈创木酚-马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）上产生红棕色氧化区。D. raonikayaporum 产生的氧化区最明显，故被用于后续脱色研究；无愈创木酚对照无红棕色，支持颜色来自愈创木酚氧化。

3.3 脱色实验
未接种对照未见可见颜色变化或显著吸光度降低。接种真菌培养约88.75%染料去除。OFAT优化显示，pH 7时脱色最高约80%，pH 3和pH 11约20–25%；30°C时最高约82%，20°C和35–45°C降低，45°C最低；初始染料浓度100 mg/L时最高，浓度升高后效率下降。说明近中性、中等温度和较低染料浓度有利于脱色。

3.4 热灭活生物量实验
非生物对照仅约2–3%脱色；热灭活 D. raonikayaporum 生物量约23%；活生物量约96–97%。表明生物量相关相互作用和代谢活跃过程均参与 CR 去除，活体贡献更大。

3.5 漆酶和MnP酶活评价
MnP 活性在早期快速升高，48 h最大达148.6 U/mg protein，随后下降；漆酶活性较低，72 h最大达38.5 U/mg protein，但持续时间更长。作者指出酶活与脱色时间相关，但未实验证明直接催化作用，应视为关联而非因果。

3.6 无细胞上清液活性
非生物对照约2–3%，热灭活上清液约6–7%，活性无细胞上清液约63%，活生物量约97%。表明可溶性胞外组分显著贡献 CR 转化。

3.7 UV–Vis评价
CR 在约498 nm具有特征最大吸收。未接种对照保持强吸收；真菌处理0–72 h内498 nm吸光度逐渐下降，72 h最明显，培养液由红色变为淡黄色。UV–Vis变化不能区分发色团破坏、生物吸附、沉淀或部分化学转化，因此不证明完全矿化。

3.8 动力学建模
以 ln(C₀/C_t) 对时间进行线性回归，符合伪一级动力学模型，R²=0.99725，表观速率常数 k=0.03404 h^-1。作者称该 k 值代表表观脱色/去除速率，而非确定的生物降解动力学常数。

3.9 漆酶和MnP抑制对脱色的影响
活性 CFS 在48 h达到最高脱色约87–88%。漆酶抑制后脱色降至约21%，MnP抑制后约41%；二者均显著降低，漆酶抑制降低更多，提示二者参与且漆酶贡献较大。但化学抑制剂可能非特异，结果应解释为酶参与证据。

3.10 HPLC分析
标准 CR 的保留时间约7.143 min等，校准曲线 R²=0.9959。处理样本在保留时间7.017 min，峰面积4,502,763，对应残余 CR 0.001676 μg/mL；出现 P1 2.570、P2 3.650、P3 4.890 min新峰。说明染料组成改变，但仅凭 HPLC 不能指定新峰为特定化合物。

3.11 GC–MS分析
未处理 CR 有 p-cresol、3-methylphenol 和 acetohydrazide 衍生物等峰。处理后母体染料峰消失，出现 pyrimidin-2-one 及衍生物、甲基化酚和低分子脂肪族化合物，如 9-hexadecenoic acid、2,5-octadecadiynoic acid 及其甲基酯。提示氧化酶导致偶氮键断裂和芳香核裂解。鉴定基于 NIST/Wiley 谱库匹配，未用标准品确认，应视为推定。

3.12 体外生态毒性评估
ECOSAR 预测显示，酚和嘧啶酮类水溶性高、毒性低，鱼 LC₅₀>4500 mg/L；9-hexadecenoic acid 及其甲基衍生物等脂肪族酸具中等水生毒性，LC₅₀约0.04–0.07 mg/L，但低水溶性和天然存在降低生态风险。母体峰消失和中间体出现支持偶氮键和芳香环酶裂解。

3.13 SEM和TEM分析
SEM 显示对照菌丝表面光滑、完整，处理菌丝粗糙、皱缩、塌陷和断裂。TEM 显示对照细胞壁完整、质膜连续、胞质均匀；处理细胞壁增厚不规则、广泛空泡化、胞质紊乱和质膜部分脱离。提示 CR 造成显著细胞胁迫和结构适应；但超微变化与脱色关系未直接评价。

3.14 植物毒性分析
以 Pennisetum glaucum (Bajra) 种子评估。未处理 CR 强烈抑制胚芽长约0.5 cm、胚根约1.5 cm、苗重约0.008 g、发芽约45%；水对照最高，分别约1.4 cm、4.8 cm、0.018 g、95%。降解产物 CRD 处理组为胚芽约0.8 cm、胚根约3.6 cm、苗重约0.013 g、发芽约85%，显示毒性缓解；统计显著。

讨论部分总结

讨论指出，D. raonikayaporum 是有前景的 CR 生物修复剂。既往研究多关注白腐担子菌，内生子囊菌较少。该分离株在优化条件下达98.8%脱色，处于真菌处理 CR 报道的上限，但因染料浓度、培养基、孵育时间、pH、温度、菌株和分析方法差异，不能直接断言优于其他系统。pH 7、30°C、较低染料浓度有利；OFAT不能评价变量交互作用。热灭活生物量约23%与活体约96–97%、CFS约63%结合，支持生物量相关相互作用与胞外生物活性共同参与，活体整体去除最大。漆酶和 MnP 活性与脱色相关，但未用纯化酶、重组酶或基因表达证实因果；未测偶氮还原酶（azoreductase），不能排除其贡献。UV–Vis、HPLC、GC–MS支持结构转化，但代谢物为谱库匹配推定，拟议途径为假设而非验证序列；长链脂肪酸也可能来自真菌细胞组分。酶抑制显示漆酶和 MnP 参与，漆酶抑制影响更大，但抑制剂可能非特异，且无变性 CFS 或纯酶对照。ECOSAR 与种子发芽试验支持处理后预测生态毒性和植物毒性降低，但 ECOSAR 为计算预测。局限包括单分离株、生物吸附/生物降解未独立定量、转化产物仅终末点、动力学为表观去除、未验证真实纺织废水适用性。未来需纯化酶、标准品、同位素标记、时间分辨代谢物分析、分子分析和真实废水研究。

结论翻译
本研究对源自内生菌的 Diaporthe raonikayaporum 分离株去除刚果红（Congo Red）进行了综合评估，将染料去除性能、木质素分解酶（ligninolytic enzyme）活性、动力学分析、转化产物的色谱与光谱表征、生态毒性预测、超微结构评价及植物毒性验证相结合，超越了传统脱色研究。在所测条件下，该分离株实现了高效刚果红去除，UV–Vis、HPLC 和 GC–MS 分析表明发色团丢失并形成推定鉴定的转化产物。热灭活生物量、无细胞上清液和酶抑制实验共同提示生物量相关相互作用与细胞外漆酶（laccase）/锰过氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）活性均参与该过程，但单个酶的作用仍需用纯化酶确认。与未处理刚果红相比，处理后的染料溶液显示出预测生态毒性降低（ECOSAR）和植物毒性降低（种子发芽试验）。这些来自单一分离株并在研究所述局限性下解释的发现，支持 D. raonikayaporum 作为生态友好型刚果红生物修复的有前景候选者，并为未来在真实废水条件下的机制与应用研究提供基础。