二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯（DEHP）与聚氯乙烯纳米塑料（PVC-NPs）联合暴露对斑马鱼早期发育阶段的毒性及拮抗效应

《Journal of Hazardous Materials Advances》：Toxicity and antagonistic effects of the combined exposure to di(2-ethylhexyl) phthalate and polyvinyl chloride nanoplastics on the early developmental stage of zebrafish

　　

从环境介质中分离的天然纳米塑料污染物以含多种塑料添加剂的复杂混合物形式存在。现场采集纳米材料在颗粒尺寸、表面形态和化学组成方面的异质性，对系统阐明其在水生动物中的毒性机制构成重大挑战。为此，研究人员通过机械破碎制备了具有不同粒径分布的破碎聚氯乙烯（PVC）纳米颗粒，以更好模拟天然存在的纳米塑料污染物。同时，在环境相关浓度下添加广泛使用的增塑剂邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP），以模拟真实联合暴露条件。通过一系列单一和联合暴露实验，研究人员监测了胚胎发育表型，并进一步剖析了斑马鱼幼鱼中四个相互关联的分子信号通路，分别调控外源物代谢、氧化还原稳态、细胞凋亡和神经发育。
• 1 ppm PVC-NPs的孵化毒性低于PVC-MPs。
• 10 ppm PVC-NPs显著抑制斑马鱼胚胎孵化率。
• 斑马鱼通过异源物代谢应对PVC-NPs胁迫。
• PVC-NPs对DEHP的神经毒性效应具有拮抗作用。

全球塑料制造产量持续上升，2024年达到430.9百万吨，预计2060年产量为1231百万吨，当前面临前所未有的微纳米塑料（MNPs，微米和纳米级塑料颗粒）暴露风险。统计数据显示，仅约20%塑料产品可被回收或以环境友好方式处置，近80%进入自然环境；塑料垃圾占沿海区、海底和表层海水中海洋垃圾的95%。在大量商品聚合物中，聚氯乙烯（PVC，一种高分子聚合物）风化稳定性最差，源于其对紫外辐射异常敏感。进入水生环境后，大块塑料碎片经机械摩擦、紫外光降解和微生物降解，逐渐分裂为微塑料（MPs，1 μm-5 mm塑料碎片）和更细的纳米塑料（NPs，粒径小于1 μm的塑料颗粒）。与大型塑料碎片相比，微小塑料颗粒易被水生生物摄入，并可破坏免疫、消化和神经系统功能。血脑屏障曾被认为是最强防御，但已显示对NPs的选择性通透性受损；除循环途径外，NPs还可经嗅觉神经绕过血脑屏障直接到达脑。MNPs跨屏障能力主要取决于粒径、形状、表面电荷、化学组成和生物环境中形成的“蛋白冠”。对于PVC-NPs，脂水界面吸附壳聚糖等外源大分子可重塑颗粒冠，进而影响纳米颗粒摄取和毒性。NPs可诱导斑马鱼胚胎畸形、幼鱼凋亡和胃肠损伤等；聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPs）单独不引起运动缺陷，但与6PPD-醌共暴露可通过类固醇合成和肌肉发育通路损害运动。PS-NPs固有毒性低，但可加重金属离子等其他污染物危害，纳米塑料完整生物风险仍未完全清楚。当前塑料颗粒纳米安全文献的一个常见不足是过度关注尺寸属性和计数指标，多数研究仅按聚合物类型粗略分类，而塑料颗粒详细化学组成，包括分子量分散性、低聚物组分和添加剂包，仍明显研究不足。该知识缺口妨碍整体理解这些污染物的环境分配和生物界面动力学，并削弱对其潜在健康危害的严格评估。随着塑料毒性研究进展，学者提出塑料可通过释放有害化学添加剂产生毒性危害。邻苯二甲酸酯（PAEs，一类常用增塑剂）用于增强塑料材料柔韧性和延展性，广泛用于PVC产品包括电线、地板材料和医疗器械；新冠期间广泛使用的一次性口罩中也检出高PAE浓度。此外，紫外照射、热效应、机械摩擦和化学腐蚀可破坏聚合物结构内化学键，触发纳米塑料颗粒从塑料产品释放。PAEs已被列为环境研究中的关键新兴污染物。天然地表水中PAEs浓度为0.100至50.0 μg/L，峰值可达2.00 mg/L。作为代表性PAE化合物，DEHP是无色油状物质，是PVC主要增塑剂。采用定量构效关系结合种间相关估计模型评估16种PAEs毒性，结果显示DEHP在淡水系统中生态风险最严重。PAEs被生物吸收后可干扰内源激素合成、分泌、运输、结合和代谢过程，进一步扰乱生理稳态和正常生长发育。PAEs在水生生物中的毒理学特征表现为一系列相互关联事件：从诱导生物转化酶和内分泌反应开始，进展为氧化细胞损伤、异常代谢流、激素平衡紊乱和免疫监视减弱。NPs在此类共污染系统中的作用机制仍知之甚少。紫外老化PVC颗粒具有“毒性放大效应”：不仅大幅增加对污染物的吸附能力，还与污染物协同破坏肠道屏障，双向促进两种物质进入系统循环。此前研究显示，0.1 ppm MPs在水环境中可抑制斑马鱼胚胎孵化效率和速度，而DEHP可缓解这种抑制影响；PVC-MPs与DEHP在斑马鱼中的拮抗毒性相互作用也已在前期工作中验证。其他研究证明DEHP表面电荷和官能团可显著改变纳米级颗粒迁移特征。但迄今PVC-NPs与DEHP的单独和联合毒理学影响尚未完全阐明，需要进一步系统探索。斑马鱼（Danio rerio）与人具有高遗传同源性，是毒理学研究经典模式生物。早期生命阶段水生生物对外源污染物干扰高度脆弱，因此斑马鱼胚胎和幼鱼被广泛用于微塑料和纳米塑料危害生态毒理学测定。北京北运河流域调查表明，PVC是优势微塑料类型，在水和沉积物中相对丰度分别为48.55%和45.45%；微塑料按粒径分为四组，细颗粒占较大比例；同时DEHP被检出为该区域最丰富PAEs污染物。在此项工作中，研究人员采用差速离心制备破碎PVC-NPs作为标准纳米塑料样品，选择DEHP作为标准PAE化合物，采用斑马鱼胚胎和幼鱼作为暴露模式生物，系统研究不同浓度PVC-NPs和DEHP在生长、神经发育、氧化应激、细胞凋亡和异源物代谢方面诱导的毒理学响应和分子机制。该研究阐明海洋系统中环境纳米塑料污染毒性特征，为监测PAE污染提供新思路和技术途径，也为塑料污染生物监测技术开发提供理论支持。研究人员开展的研究表明，仅高剂量PVC-NP暴露抑制胚胎孵化效率；低和中剂量纳米塑料及PVC-NPs@DEHP联合暴露对胚胎孵化影响可忽略；相同质量浓度下，纳米塑料碎片倾向表现出弱于微米塑料的致死毒性；单独和联合PVC-NPs暴露均提高幼鱼心脏跳动频率；1 ppm环境相关PVC-NPs激活AhR和核心抗氧化信号轴，可能表明斑马鱼部署异源代谢程序缓解纳米塑料应激；DEHP单独暴露诱导严重胞内氧化损伤；神经发育转录抑制表明DEHP可能损害神经元和星形胶质细胞增殖引发神经毒性，而PVC-NPs共暴露通过拮抗毒性相互作用中和DEHP来源神经损伤。
关键技术方法概要：研究人员通过机械破碎和差速离心制备PVC-NPs并进行表征；使用野生型AB斑马鱼，胚胎于6 hpf随机分为8组，包括0.1、1、10 ppm PVC-NPs，0.1、1、10 ppm PVC-NPs@DEHP，DEHP 71 μg/L及对照组；每组6个重复培养池，每池15枚胚胎，暴露9天；记录孵化率和心率；用DCFH-DA和共聚焦显微镜检测活性氧（ROS，活性氧物种）；用实时定量PCR检测解毒代谢、抗氧化防御、凋亡和神经发育相关基因；采用双因素方差分析和Duncan多重范围检验，显著性阈值设为P < 0.05，极显著阈值设为P < 0.01。样本队列来源为野生型AB斑马鱼，购自上海Fish Biology Co., Ltd.。
研究结果如下。3.1 PVC-NPs的制备与表征：扫描电镜显示制备PVC-NPs平均流体动力学直径为528.6 nm，多分散指数（PDI）为0.443，表明粒径分布较宽；0.15至0.7 μm粒径范围质量产量为数毫克至十几毫克，足以支持水生毒理暴露实验；拉曼光谱显示635 cm^-1、1427 cm^-1和2912 cm^-1特征峰，分别对应C-Cl伸缩振动、CH₂弯曲振动和亚甲基C-H伸缩振动，与块状PVC和PVC-MPs光谱高度一致，说明机械粉碎仅改变粒径，未明显改变化学组成。3.2 单独和联合暴露PVC纳米塑料和DEHP对斑马鱼胚胎的发育毒性。3.2.1 孵化率：对照组孵化比例为98.10%，1 ppm PVC-NPs组为99.12%，10 ppm PVC-NPs组显著降至87.60%，10 ppm PVC-NPs与DEHP共处理恢复至95.54%；中高PVC-NP剂量剂量依赖地减慢孵化进程并降低总孵化率，DEHP缓解纳米塑料诱导的孵化抑制，但对孵化速度调节不显著。3.2.2 心率：1 ppm PVC-NPs组在24和48 hpf心率分别为115.33和122.66 bpm，显著高于对照组98和86 bpm，DEHP未显著逆转这一刺激表型，联合暴露组为119.33和119.33 bpm；单纳米塑料暴露仅在中高浓度明显改变心律。3.3 PVC-NPs和DEHP对斑马鱼幼鱼的毒性。3.3.1 DEHP和PVC-NPs的解毒与代谢机制：0.1和1 ppm PVC-NPs显著上调相0解毒转运体P-糖蛋白（P-gp，外排转运体）转录，1 ppm PVC-NP强烈激活芳烃受体（AhR，配体激活转录因子）转录，而DEHP单独及联合暴露显著抑制AhR；CYP1a1与AhR趋势一致，CYP1b1反应弱，仅高浓度联合暴露显著下调；相II解毒标志谷胱甘肽S-转移酶（GST）仅在10 ppm PVC-NP单独暴露显著过表达；相III外排转运体方面，DEHP单独显著抑制ABCC1和MRP1，低剂量纳米塑料诱导ABCC1和MRP1转录上调，该效应可被DEHP单独处理抑制，联合暴露部分缓解DEHP介导的基因抑制。3.3.2 PVC-NPs和DEHP胁迫下斑马鱼幼鱼抗氧化防御系统机制：1 ppm PVC-NPs显著激活Nrf2、Keap1、CAT、Cu/Zn-SOD和GPx等核心抗氧化调节基因；DEHP单独暴露抑制这些抗氧化相关转录；ROS荧光检测显示DEHP单独处理幼鱼胞内ROS远高于1 ppm PVC-NPs单独或PVC-NPs与DEHP混合组；联合暴露也上调抗氧化基因，但激活幅度明显弱于单纳米塑料组。3.3.3 PVC-NPs和DEHP对斑马鱼幼鱼凋亡调控基因的调节机制：10 ppm PVC-NP暴露显著升高促凋亡标志Bax、p53和Caspase9转录，1 ppm纳米塑料也刺激p53和Caspase9上调；DEHP单独处理对凋亡信号转录影响可忽略；联合暴露减弱高浓度PVC-NPs诱导的促凋亡基因过表达。3.3.4 PVC-NPs和DEHP对斑马鱼幼鱼神经发育调控基因的调节机制：单独PVC-NPs暴露导致神经发育相关基因syn2a、mbp、gfap显著转录升高，elavl3呈升高趋势；DEHP单独暴露抑制这些神经功能转录；shha在所有八组中无统计学显著波动；PVC-NPs与DEHP联合处理抵消单独污染物暴露诱导的转录紊乱。
讨论部分总结。4.1 DEHP和PVC-NPs对斑马鱼胚胎毒性：仅高剂量PVC-NP暴露抑制胚胎孵化率，低/中PVC-NP和DEHP联合暴露无统计学可检测不良影响。相同1 ppm质量浓度下微米和纳米PVC片段存在显著毒性差异：此前微塑料研究记录1 μm-2 mm PVC微塑料明显抑制孵化，而等效纳米塑料剂量未干扰孵化。微米级塑料碎片易粘附外卵膜且不能穿越约500 nm膜孔，持续表面附着引起胚胎包膜机械磨损，损伤胚胎结构并提高死亡风险；低中浓度亚微米塑料颗粒易穿过绒毛膜孔而不干扰正常胚胎生长。10 ppm才显著抑制孵化提示阈值响应，一种可能物理机制是PVC-NPs在胚胎绒毛膜吸附积累，超过临界阈值后堵塞绒毛膜孔，干扰气体交换，导致孵化率降低。纳米塑料可穿过先天绒毛膜屏障，孵化前在胚胎表面和内部积累；DEHP可能吸附到微/纳米塑料表面并改变颗粒表面性质，进一步改变塑料颗粒吸附行为。研究人员推测DEHP可能吸附到PVC-NPs表面并削弱纳米颗粒与绒毛膜结合力，但本研究无直接实验证据。纳米塑料因表面静电势改变而对卵膜具有更高结合亲和力，这种吸附可能形成胚胎周围局部缺氧微环境并延长孵化周期；心率升高可能与绒毛膜结合纳米塑料诱导的局部缺氧有关。DEHP与PVC-NPs共存时，增塑剂粘附纳米塑料表面，削弱颗粒-绒毛膜结合力，缓解孵化延迟表型。混合污染系统毒性结果仍有争议；本胚胎暴露中联合组孵化比例与单一污染物组相当，无显著统计差异。其他纳米塑料共暴露模型有不同报道，例如与酮康唑或氟康唑共暴露抑制胚胎孵化、存活和心脏活动并提高畸形率，与多氯联苯共暴露加剧毒性。所有单独PVC-NPs或PVC-NPs@DEHP联合暴露组均显示胚胎心脏跳动频率升高；结合孵化和胞内ROS数据，心脏加速可归因于卵膜纳米塑料聚集体诱导局部胚胎缺氧。心肌MNPs积累，以纳米塑料为主，与心肌纤维化严重程度显著正相关。相反，低剂量0.1 ppm PVC-NPs在24 hpf心率轻微抑制但无统计学意义；既往PS-NPs研究记录发育和生殖损害伴胚胎心率降低，但仅见于超高剂量200和400 ppm。总体而言，环境现实PVC-NP浓度对斑马鱼胚胎心脏和发育危害可忽略；严重纳米塑料污染远高于环境水平时需重新评估风险结论。4.2 DEHP和PVC-NPs对斑马鱼幼鱼毒性：纳米塑料与共存污染物相互作用受关注。分子转录测定比表型观察和蛋白生化测定更敏感。0.1和1 ppm PVC-NPs上调相0和相III外排转运体P-gp、ABCC1和MRP1，表明纳米塑料暴露诱导全套相0和相III清除途径；胞内纳米塑料可经这些跨膜转运蛋白排出。1 ppm PVC-NP显著升高CYP1a1，与PS-NPs上调斑马鱼CYP1A和CYP51一致。高剂量10 ppm与低/中剂量0.1、1 ppm解毒基因转录谱不同。AhR是配体激活转录因子，调控水生污染物生物转化并介导后续毒表型；1 ppm PVC-NPs强激活AhR，证明斑马鱼启动异源代谢级联对抗纳米塑料。DEHP单独处理显著抑制AhR和CYP1a1，与部分脊椎动物毒理发现不一致，研究人员将其主要归因于DEHP对AhR信号的剂量依赖效应和雌激素受体（ER）与AhR通路独特串扰。DEHP及活性代谢物MEHP靶向激活ERα/ERβ，活化核ER可招募到AhR启动子区并招募抑制复合物，引起染色质凝缩，转录抑制AhR并最终抑制CYP1a1。累积毒理证据表明纳米塑料污染触发ROS过积累，SOD、CAT、GST和Nrf2-Keap1轴通过ROS清除、中和和毒物清除维持细胞稳态。1 ppm PVC-NP暴露强上调抗氧化反应和Nrf2-Keap1信号核心转录；Nrf2和负调节因子Keap1协同上调代表补偿性稳态反馈环。DEHP单独处理抑制核心抗氧化基因并导致更高胞内ROS，环境现实DEHP剂量抑制SOD-CAT抗氧化轴，与Nrf2-Keap1转录谱改变密切相关。单独纳米塑料触发抗氧化防御，单独DEHP损害抗氧化缓冲，联合形成混合调节表型。p53是经典肿瘤抑制蛋白，通过协调细胞周期、凋亡和抗氧化机器调控应激耐受；10 ppm PVC-NP暴露显著升高Bax和Caspase-9转录，证实纳米塑料对斑马鱼幼鱼凋亡毒性；联合暴露未触发凋亡标志明显上调，证实DEHP对PVC-NP诱导促凋亡转录具有拮抗作用。神经毒性方面，DEHP穿透脑组织并损害中枢神经系统功能；单独PVC-NPs暴露强上调syn2a、Mbp、Gfap和Elavl3，而DEHP单独剂量可变地抑制这些神经转录。研究者指出，PVC-NP单独暴露下结构神经基因显著上调代表病理性神经扰动而非有益发育增强，gfap过高提示反应性星形胶质增生，mbp和syn2a升高反映髓鞘形成失调和突触发生紊乱。尽管PVC-NPs单独诱导异常上调，与DEHP共暴露显示PVC-NPs可逆转DEHP引起的这些神经基因转录抑制，从而对DEHP相关神经毒性发挥拮抗。总体而言，观察到的拮抗相互作用可能归因于DEHP吸附到PVC-NPs上，可能降低暴露溶液中游离溶解DEHP浓度；尽管本研究未直接进行吸附测量，DEHP强疏水性及其既往报道对PVC颗粒的吸附支持这一解释。研究结论翻译：本研究系统表征了PVC-NPs和DEHP在斑马鱼胚胎发育期间诱导的单独和联合毒性表型，并探索了幼鱼中异源生物转化、抗氧化平衡、凋亡信号和神经成熟潜在分子调控级联。仅高剂量PVC-NP暴露被观察到抑制胚胎孵化效率；低和中剂量纳米塑料以及PVC-NPs@DEHP联合暴露对胚胎孵化影响可忽略。在相同质量浓度下，纳米塑料碎片倾向表现出弱于微米塑料的致死毒性。这种差异可能源于尺寸依赖的绒毛膜穿透：亚微米PVC-NPs易穿过胚胎包膜微孔，对胚胎膜产生最小机械损伤。单独和联合PVC-NPs暴露均提高幼鱼心脏跳动频率。暴露于1 ppm环境相关PVC-NPs激活AhR和核心抗氧化信号轴，可能表明斑马鱼部署异源代谢程序以缓解纳米塑料诱导的应激。相反，DEHP单独暴露诱导严重胞内氧化损伤。神经发育转录抑制表明DEHP可能损害神经元和星形胶质细胞增殖以引发神经毒性，而PVC-NPs共给药通过拮抗毒性相互作用中和这种DEHP来源的神经损伤。本研究构成对PVC-NPs和DEHP共污染联合毒理学危害的系统探索。后续研究将进一步剖析单一和联合纳米塑料-邻苯二甲酸酯毒性的潜在分子调控网络，并通过蛋白定量和体内功能实验进行验证。