竞争性侧向层析分析实现环境水体中肠球菌属（Enterococcus）全细胞CFU当量快速定量

《Journal of Hazardous Materials Advances》：Rapid CFU-Equivalent Quantification of Enterococcus in Environmental Waters via a Competitive Lateral Flow Assay

　　

竞争性侧向层析分析（lateral flow assay, LFA）能够实现肠球菌属（Enterococcus）的CFU当量定量。竞争性LFA能够在25 min内实现无培养的全细胞检测。其在淡水和海水基质中具有稳健性能。其与平板计数呈强相关（r = 0.984，p < 0.001）。在储存超过4个月后仍保持稳定的定量性能。

环境水体粪便污染对公共健康构成持续风险，尤其在娱乐和沿海环境中人类暴露频繁，可导致胃肠道疾病、皮肤感染及其他水传播疾病。及时评估微生物水质对于海滩预警和关闭等管理行动至关重要，但当前监测框架多依赖实验室分析，采样与决策之间存在延迟，限制公共卫生响应。肠球菌属（Enterococcus spp.）是环境水体粪便污染的国际监管指示菌，韩国海滩微生物水质标准为≤100菌落形成单位（colony-forming units, CFU）/100 mL或≤100最大可能数（most probable number, MPN）/100 mL。传统膜过滤和选择性培养可可靠定量，但需18–24 h培养；定量PCR等分子方法分析时间短，却量化核酸而不反映细胞活力，报告基因拷贝数，不能直接与基于CFU的监管阈值比较。生物传感器、微流控平台和侧向层析分析（LFA）等快速检测技术有现场监测潜力，但多数LFA针对可溶性靶标，不适合全细菌细胞定量。传统夹心格式LFA依赖在多孔膜内同时捕获和标记完整细胞，空间位阻、表位可及性有限和异质运输会显著降低检测效率。因此，现有快速分析方法很少提供可直接解释为CFU当量单位的定量输出，限制其监管监测适用性。研究人员因此开发一种竞争性LFA，通过将抗原–抗体相互作用转移至溶液相，缓解全细胞检测的空间限制，实现环境水体中全细胞肠球菌属的快速、无培养定量，并使其输出可直接以CFU当量解释，以连接快速检测与监管要求。

研究人员构建了竞争性LFA，并在多株肠球菌、环境基质和真实水样中系统评估性能。结果显示，该法可在样品制备后约25 min获得定量结果，分析范围为10¹–10⁷ CFU/mL，11株肠球菌的检测限（limit of detection, LOD）为14.49–39.25 CFU/mL，与基于培养的计数在河流和沿海水样中强相关（r = 0.984，p < 0.001）。该研究意义在于为快速筛查和初步水质评估提供及时定量信息，并可能为侧向层析平台中受空间位阻限制的整细胞定量检测提供通用策略。

关键技术方法概括：该研究采用半条格式竞争性LFA，在硝酸纤维素膜测试线固定E. faecalis KCTC 5191全细胞，对照线固定anti-rabbit IgG；制备抗体–金纳米颗粒偶联物，并优化测试线固定密度和偶联物浓度。使用11株Enterococcus和7株非靶标菌评估分析性能、选择性和干扰；检测活细胞、高压灭菌灭活细胞及其混合物；在自来水、淡水和海水中进行加标基质效应评价。环境水样来源于2023年8月韩国Suyeong River五个淡水点和Haeundae Beach五个海水点；加标水样来源包括Daecheon Stream、Gwangalli Beach和Busan实验室自来水。统计方法包括线性回归、LOD和定量限（limit of quantification, LOQ）计算、bootstrap分析、方差分析、Pearson相关、Bland–Altman分析和Deming回归。

3.1 竞争性LFA用于全细胞检测的设计原理：研究人员采用竞争性侧向层析结构，以半条格式使抗体–金纳米颗粒偶联物在膜迁移前与细菌细胞在溶液相相互作用。由于靶标为完整细胞，测试线固定全细胞以保留抗体识别的天然表面表位。无靶标时，游离抗体–金偶联物结合测试线固定细胞，产生强测试线信号；有靶标时，偶联物优先结合溶液中的细胞，减少可用于测试线捕获的游离偶联物，使测试线信号随靶标浓度升高而降低，控制线/测试线强度比（R_CL/TL）随靶标浓度增加而升高。对照线通过anti-IgG相互作用捕获偶联物，确认流动和测定有效性。

3.2 测试线固定与偶联物浓度的优化：研究人员系统优化测试线固定细菌量和抗体–金纳米颗粒偶联物浓度，以获得定量分辨能力。

3.2.1 测试线固定密度优化：增加固定E. faecalis KCTC 5191浓度（10¹–10⁷ CFU/mL）会逐步提高阴性对照条件下测试线强度；无固定细胞时无可见测试线，表明信号依赖对测试线E. faecalis细胞的特异性结合。低固定密度信号弱，基线不足；较高固定密度产生更强、更稳定测试线信号。根据信号强度和基线稳定性，选择10⁷ CFU/mL为最佳测试线条件。

3.2.2 偶联物浓度优化：增加偶联物浓度（OD₅₃₀ = 0.1–1.0）增强总体信号，但OD₅₃₀ = 0.1时信号发展不足，OD₅₃₀ ≥ 0.6时0和10⁷ CFU/mL样品间信号差异降低，可能因测试线部分饱和。R_CL/TL在OD₅₃₀ = 0.4时阴性样品与阳性样品差异最大，竞争性信号区分最大化，故选择该条件。

3.3 分析灵敏度与定量性能：优化后的竞争性LFA用11株肠球菌评估。E. faecalis KCTC 5191测试线强度随细菌浓度升高而降低，高浓度10⁷ CFU/mL时测试线几乎不可见，对照线信号随测试线信号降低而增加。R_CL/TL随细菌浓度对数在10¹–10⁷ CFU/mL范围内线性增加，R² = 0.98。另外10株肠球菌均呈浓度依赖响应，R²为0.96–0.99；11株LOD为14.49–39.25 CFU/mL，LOQ为48.30–130.83 CFU/mL。活细胞显示浓度依赖性R_CL/TL升高，高压灭菌灭活细胞在测试浓度下接近阴性对照，活细胞与灭活细胞混合物响应与单独活细胞类似，表明灭活细胞在该条件下对竞争性LFA响应贡献很小。与既往依赖核酸扩增的Enterococcus LFA和复杂生物传感平台相比，本竞争性LFA结合直接全细胞检测与快速定量分析，可直接以CFU当量单位输出。

3.4 选择性与对非靶标细菌干扰的稳健性：研究人员用高浓度非靶标菌评估选择性。仅含非靶标菌E. coli、S. sonnei、S. pneumoniae、S. aureus、C. freundii、E. roggenkampii和P. aeruginosa（各10⁷ CFU/mL）的样品产生R_CL/TL与阴性对照无统计学差异。E. faecalis KCTC 5191在10¹–10⁷ CFU/mL范围内与E. coli、S. sonnei或二者同时存在（10⁷ CFU/mL）时，R_CL/TL仍随Enterococcus浓度增加，单靶标样品与含非靶标样品之间无统计学显著差异，表明高浓度非靶标菌未实质影响测定响应。

3.5 加标环境水样的基质效应评价：研究人员将E. faecalis KCTC 5191加标至自来水、淡水和海水（0–10⁷ CFU/mL），并与10 mM PBS比较。竞争性LFA在不同理化特征水基质中均显示R_CL/TL浓度依赖性升高，整体响应模式与PBS相当，各浓度水平无统计学显著差异。基质相关信号回收率为87.50%–103.73%，表明测试水基质未实质影响竞争性LFA响应。

3.6 竞争性LFA在环境水中的应用：研究人员将竞争性LFA应用于河流和沿海环境水样，并与基于膜过滤的培养计数直接比较。用于淡水Suyeong River和海水Haeundae Beach的基质匹配校准曲线回归斜率与PBS校准相似，95%置信区间重叠。LFA测得的Enterococcus浓度与培养计数趋势相当；所有环境样品中两法强正相关（r = 0.984，p < 0.001）。Bland–Altman分析平均偏差为?23.74 CFU/100 mL（95% CI，?60.97至13.49 CFU/100 mL），95%一致性界限为?123.80至76.33 CFU/100 mL。Deming回归截距为5.09 CFU/100 mL，斜率为0.805（95% CI，0.610–1.000）。平均绝对偏差、相对偏差和均方根误差（root mean square error, RMSE）分别为30.34 CFU/100 mL、?21.86%和53.94 CFU/100 mL。负平均偏差和相对偏差表明竞争性LFA倾向于给出低于培养计数的估计，但平均偏差95% CI包含零。在娱乐用水参考水平100 CFU/100 mL下，两法分类一致：同样两个样品高于参考水平，八个样品低于参考水平。与Busan市政监测项目同日Enterococcus监测数据描述性比较显示浓度范围重叠，但因采样设计和计数方法不同（CFU当量对MPN），该比较仅提供环境背景，不是LFA直接验证。传统培养计数需18–24 h培养，竞争性LFA本身在样品制备后25 min内提供定量结果；本研究所用环境样品因膜过滤预浓缩，完整样品到结果时间约56 min。局限性包括：膜重悬相关回收效率和变异性未独立量化，高浊度条件下过滤性能未系统评估；高压灭菌灭活细胞在测试条件下响应极小，但不能据此建立对活细胞与非活细胞的一般区分，且该法不能区分可培养细胞与活但不可培养（viable but non-culturable, VBNC）细胞；现场评价限于单一采样期和地理受限位点，定量成像使用单一智能手机并在受控条件下进行；需在多样环境条件和成像配置中开展更广泛验证以确立稳健性和普适性。

3.7 竞争性LFA的储存稳定性：研究人员在不同温度评估竞争性LFA试纸条和偶联物组分的储存稳定性。冷藏条件（4和10°C）下，对照线和测试线信号在长达139天内基本保留；4°C时相对信号强度约为初始值的80–90%，表明固定试剂和偶联物功能降解最小；10°C时信号逐渐下降但仍高于初始基线70%，显示中等冷藏条件下可接受稳定性。较高温度（20–37°C）加速信号衰减；20°C时信号逐渐下降，但60天后仍高于约50%；30和37°C下降更明显，可能因抗体–金纳米颗粒偶联物热不稳定和膜上固定蛋白部分变性。R_CL/TL在冷藏条件下保持稳定，表明储存期间竞争性信号行为和定量能力得以保留。

讨论部分总结：该研究开发的竞争性LFA可实现全细胞肠球菌属快速定量检测，具有10¹–10⁷ CFU/mL分析范围和14.49–39.25 CFU/mL的LOD，样品制备后约25 min获得定量结果；在测试水基质中表现一致，并在河流和沿海水样中与培养计数强相关（r = 0.984，p < 0.001）。尽管基于培养的方法仍是确定性计数的参考，竞争性LFA可为快速筛查和初步水质评估提供及时定量信息。除Enterococcus检测外，该竞争性架构可能为侧向层析平台中定量全细胞检测提供可推广策略，尤其适用于空间位阻限制夹心格式分析性能的靶标。研究结论翻译为：本研究中开发的竞争性LFA能够对全细胞肠球菌属进行快速定量检测。该分析在11株Enterococcus中表现出10¹–10⁷ CFU/mL的分析范围和14.49–39.25 CFU/mL的LOD，并在样品制备后约25 min内获得定量结果。该分析在测试水基质中也表现出一致的定量性能，并在河流和沿海水样中与基于培养的计数呈强相关（r = 0.984，p < 0.001）。尽管基于培养的方法仍是确定性计数的参考，竞争性LFA为快速筛查和初步水质评估提供了及时定量信息。除Enterococcus检测外，这里展示的竞争性架构可能为侧向层析平台中的定量全细胞检测提供可推广策略，特别是对于空间位阻限制夹心格式分析性能的靶标。该研究由Yunsoo Chang、Seung-Woo Lee和Eun-Hee Lee完成。